Inquadramento del problema e dello scopo generale della ricerca
Il recettore purinergico P2X7, espresso sulle cellule moncito-macrofagiche e dendritiche, sulle mastcellule, sui fibroblasti e sulle terminazioni nervose sensitive, si lega alla molecola ATP, quando essa viene rilasciata in sede extracellulare, nel corso di processi che determinano un danno cellulare, quali le infiammazioni. L'ATP extracellulare funziona come mediatore dell'impulso pro-dolorifico, analogamente alla sostanza P ed al "calcitonin-gene-related peptide" ed è responsabile delle manifestazioni neuro-infiammatorie. Abbiamo già dimostrato che la molecola oATP, che è in grado di inibire i recettori P2X7, possiede una notevole attività antinfiammatoria in vivo, in numerosi modelli sperimentali di artrite nel ratto e nel topo. Inoltre abbiamo evidenziato la presenza in vitro di recettori P2X7 a livello delle cellule endoteliali. I dati ottenuti ci hanno suggerito di verificare la presenza di una eventuale attività di oATP sulle cellule endoteliali. Abbiamo ipotizzato per tale molecola una funzione anti-angiogenetica, non necessariamente P2X7-mediata, tenendo conto che spesso tale ruolo è svolto dai farmaci antinfiammatori.
Lo scopo della ricerca è quello di identificare la possibile attività antiangiogenetica di oATP
Materiali e metodi
Utilizzeremo colture di HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) ottenute da cordone ombelicale umano. Studieremo la proliferazione delle HUVEC in presenza di oATP (di cui preliminarmente verrà identificata la dose da utilizzare), ed in presenza o in assenza di un noto fattore pro-angiogenetico, il vascular endothelial growth factor (VEGF). Analizzeremo l'espressione di P2X7 da parte delle HUVEC nelle differenti condizioni sperimentali. Poiché VEGF incrementa la permeabilità endoteliale, studieremo le modulazioni di tale permeabilità indotte da oATP. A tal fine utilizzeremo un sistema "transwell" a doppia camera, in grado di misurare il passaggio di leucociti mononucleati, ottenuti da sangue periferico umano, attraverso le HUVEC disposte in monostrato. L'attività anti-angiogenetica verrà testata anche in presenza di fattori attivanti l'endotelio, quali le citochine TNF alfa ed IL-1. L'attività anti-angiogenetica di oATP in vivo verrà verificata ponendo la molecola su materiale inerte (matrigel) posizionato in sede sottocutanea a livello cervico-dorsale in animali da esperimento (topi), al fine di valutarne la capacità di favorire o di inibire la proliferazione di cellule endoteliali. Studieremo inoltre la attività pro-apoptotica di oATP nei confonti delle HUVEC e dei leucociti mononucleati. L'apoptosi verrà valutata mediante analisi citofluorimetrica, dopo colorazione delle cellule con annessina V-FITC coniugata
Obiettivo specifico
L'obiettivo della ricerca è quello di mettere in luce le diverse attività di oATP, sia P2X7-dipendenti che P2X7-indipendenti, allo scopo di modularne meglio le possibilità di impiego a livello terapeutico