Effetto di mutazioni della Presenilina-1 nella resistenza di linee cellulari leucemiche al trattamento con inibitori della Gamma-Secretasi

Uno dei bersagli farmacologici più importanti nel trattamento del morbo di Alzeihmer è la gamma-secretasi, un complesso multiproteico responsabile della generazione del peptide beta amiloide. Il nucleo catalitico del complesso si trova nella presenilina 1, una proteasi transmembrana la cui attività dipende da due residui aspartici situati nei domini transmembrana 6 e 7; il dominio transmembrana 9 e il loop citoplasmatico idrofobico VII intervengono nella stabilizzazione del sito catalitico. Il complesso della gamma-secretasi interviene anche nel processamento degli oncogeni della famiglia Notch, operando uno dei tagli proteolitici necessari per la traslocazione nucleare della forma attiva di Notch. Il pathway di Notch interviene nella regolazione della proliferazione, della apoptosi, e del destino cellulare durante lo sviluppo di numerosi lineage cellulari; numerose mutazioni che alterano la funzione e la stabilità di tale proteina sono state rilevate sia in tumori solidi che in forme ematologiche. Gli inibitori dell¿attività gamma-secretasica (GSI) sono in grado di rallentare la crescita di alcune linee cellulari derivate da leucemia linfoblastica acuta di tipo T (T-ALL) e di linfoma B che presentano mutazioni attivanti il pathway di segnalazione dell¿oncogene Notch. Recentemente sono iniziati studi clinici per l¿utilizzo di composti GSI per il trattamento di forme refrattarie di T-ALL. Il nostro laboratorio ha analizzato numerose linee T-ALL per la responsività a vari tipi di farmaci GSI (DAPT, GSI-I, GSI-IX e L-685,458), e ha rilevato l¿esistenza di linee resistenti ai trattamenti indipendentemente dalla presenza di mutazioni che attivano l¿oncogene Notch1. Il presente progetto si prefigge di delucidare se mutazioni che iperattivano la presenilina 1 possano intervenire nella resistenza di linee tumorali T-ALL al trattamento con farmaci di tipo GSI. L¿effetto dell¿attività della presenilina 1 sul differenziamento, sulla progressione del ciclo cellulare e sulla induzione dell¿apoptosi verrà valutato dopo ablazione specifica dell¿espressione mediante tecnica di RNA interference sia su linee resistenti al trattamento con farmaci GSI che su linee sensibili che presentano mutazioni attivanti Notch1. In parallelo verrà valutata l¿attivazione del pathway di Notch attraverso l¿analisi di bersagli molecolari specifici, quali l¿espressione di Hes1, Hes5 e pre-TCRalfa. Questa analisi preliminare permetterà di correlare il contributo dell¿attività della gamma-secretasi allo sviluppo del fenotipo tumorale. La presenza di mutazioni nel gene della presenilina 1 verrà ricercata attraverso la metodica SSCP e successiva conferma attraverso sequenziamento diretto concentrando l¿attenzione sulle regioni della proteina che intervengono nella creazione del sito catalitico. L¿attività biochimica di eventuali forme mutate di presenilina 1 sarà valutata mediante saggi biochimici specifici.