Identificazione di partner proteici della rodanesi (RhdA) di Azotobacter vinelandii mediante TAP-tagging genomico.

Questa proposta si inserisce in un più ampio progetto riguardante la caratterizzazione funzionale delle proteine "rhodanese-like". Evidenze sperimentali del nostro laboratorio (1, 2, FIRST2006), suggeriscono che la funzione della rodanesi (RhdA) di Azotobacter vinelandii dipenda dall¿interazione con proteine specifiche (per esempio: IscS). Quindi, si intende identificare le proteine che interagiscono con RhdA per poter ricavare informazioni sul suo coinvolgimento in determinati processi cellulari, il cui significato può essere esteso a tutta la numerosa superfamiglia di omologia delle proteine "rhodanese-like". A tal fine sono stati costruiti ceppi di A. vinelandii (UW3TAP, UW5TAP)(FIRST2007) in cui il gene RhdA è stato sostituito, mantenendo le regioni 3'-upstream native, con varianti di RhdA contenenti in posizioni diverse un "tag" multiplo idoneo per la "Tandem-Affinity Purification" (TAP)(3). Analisi western su estratti grezzi e direttamente su cellule lisate di questi ceppi hanno dimostrato che le varianti "TAP-tagged" di RhdA vengono espresse in forma solubile ed in quantità equiparabili all'espressione nativa di RhdA nel ceppo wildtype di riferimento (FIRST2007). Il progetto proposto si articolerà in: 1) ottimizzazione delle singole fasi della TAP mediante analisi western ed analisi di attività rodanesica; 2) TAP su estratti grezzi preparati dai ceppi UWTAP cresciuti in diverse condizioni (per esempio: terreno ricco, terreno privo di fonte di azoto, terreno in presenza di ossidanti come il N-metilfenazonio methosolfato) in confronto con il ceppo wildtype (UW136); 3) analisi SDS-PAGE e/o 2D-PAGE delle frazioni ottenute con la TAP; 4) identificazione delle proteine co-purificate insieme a RhdA TAP-tagged mediante analisi di spettrometria di massa. 1. Cereda et al. (2003) Biol. Chem. 384, 1473 2. Forlani et al. (2005) FEBS Lett. 579, 6786 3. Puig et al. (2001) METHODS 24, 218