Infezione da Papillomavirus umano e tumori ano-genitali: identificazione ed analisi filogenetica di varianti virali dei genotipi ad alto rischio oncogeno HPV-16 ed HPV-18. Valutazione del potenziale oncogeno e della possibile emergenza di escape-mutants

E' stata ampiamente dimostrata a livello internazionale la relazione causale tra infezione da Human Papillomavirus (HPV) e sviluppo di tumori dell'area ano-genitale. HPV è stato infatti riscontrato nel 100% dei tumori della cervice uterina ed in circa il 90% dei tumori anali. Degli oltre 100 genotipi di HPV identificati, circa 40 infettano le mucose ano-genitali e sono distinti in tipi ad alto (HR-HPV) e basso rischio (LR-HPV) oncogeno. HR-HPV prevalenti a livello mondiale sono HPV-16 e 18, responsabili del 70% circa dei casi di cancro cervicale. Del tipo 16 sono conosciute varianti con differente grado di infettività e patogenicità, distinte in 6 lineages filogenetici (europei/non-europei). Limitate sono invece le conoscenze sulle varianti del tipo 18. La prevenzione dell'infezione è mirata, oltre al mantenimento dei programmi di screening (Pap-test), ad interventi di prevenzione primaria, essendo attualmente disponibili due vaccini profilattici, allestiti con proteine capsidiche L1 dei tipi HPV-16 e -18 assemblate in VLPs (Virus Like Particles), in grado di conferire protezione tipo-specifica. OBIETTIVI a) caratterizzare e studiare mediante analisi filogenetica varianti di HPV-16 e 18 (regione genomica LCR) in soggetti HPV-infetti per verificarne il lineage di appartenenza e l'associazione con la gravità del quadro clinico b) valutare la circolazione nella popolazione di varianti di HPV-16 e 18 (gene L1 codificante per la proteina delle VLPs) potenzialmente in grado di eludere la risposta immunitaria indotta da vaccino (escape mutants) METODI In questo studio verranno analizzati circa 150 campioni citologici (cervicali o anali) raccolti da 518 soggetti HIV-1 positivi (346 M, 172 F) e da 354 donne della popolazione generale, con infezione da HPV sostenuta dai genotipi HPV-16 e 18. Per la caratterizzazione delle regioni LCR ed L1 verranno allestite specifiche reazioni di amplificazione genica (PCR). In particolare, per la regione LCR di HPV-16 verrà amplificato un frammento di 730 pb mediante la coppia di primer: LCR-16-s (5' - GCTTGTGTAACTATTGTGTCA - 3'); LCR- 16-as (5' - GTCCAGAAACATTGCAGTTCT - 3'), mentre per quella di HPV-18 un frammento di 1139 pb, mediante primer: LCR-18-s (5' - TACGTGCCAGGAAGTAATATGT- 3'); LCR-18-as (5' - TGTATAACCCAGTGTTAGTTAG - 3'). Per valutare la circolazione di varianti virali escape in L1, verranno amplificati frammenti del gene L1 di HPV-16 (1498pb) e di HPV-18 (1823pb) utilizzando i seguenti primer: L1-16-s (5'-ATGTCTCTTTGGCTGCCTAG- 3'); L1-16-as (5'-GTTTAGCAGTTGTAGAGG TAGATGA-3'); L1-18-s(5'-CCACTATATCTTCTGCCTCTTCCTA-3'); L1-18-as(5'-CAAACACAGGACATACA AACACAACA-3'). I frammenti ottenuti (LCR e L1) verranno sequenziati e sottoposti ad analisi filogenetica mediante programmi ClustalX, BioEdit, PAUP e Mega. Le sequenze aminoacidiche di L1 verranno analizzate per la presenza di mutazioni a livello dei siti immunodominanti, potenzialmente coinvolti nella emergenza di escape mutant.