Studi sulla stabilità alla proteolisi e sullo stato di associazione di una proteina biologicamente attiva del seme di lupino

Da diversi anni il nostro laboratorio sta conducendo ricerche sulle proteine dei semi di leguminose, ed in particolare del seme di lupino. Tali ricerche, tutte caratterizzate da un approccio prettamente molecolare, si rivolgono a vari aspetti di base ed applicativi, tra cui i rapporti struttura/funzione di queste proteine, le loro proprietà biologico/funzionali, nonché le possibilità di un loro utilizzo ottimale in qualità di proteine alimentari e nutraceutiche. Una di queste proteine, la conglutina gamma, possiede insolite capacità di interazione con se stessa e con altre proteine, tra cui l'insulina di mammifero, e si è dimostrata in grado di ridurre significativamente la curva glicemica in prove di sovraccarico da glucosio in animali modello [1]. L¿interesse per questa attività biologica è evidente, tuttavia non sono note le modalità con cui la proteina svolga questa funzione. Tra le varie caratteristiche peculiari di questa proteina oligomerica, la sua insolita stabilità alla proteolisi non è stata ancora studiata in relazione al suo stato di aggregazione, benché questi aspetti siano verosimilmente determinanti per il manifestarsi dell'attività biologica. Pertanto in questa ricerca ci si propone di studiare entrambe le citate proprietà, come esse si influenzino reciprocamente e come siano a loro volta modulate da parametri quali pH, forza ionica, concentrazione della proteina, presenza o meno di metalli, che la proteina è peraltro in grado di legare. A questo scopo, frazioni altamente purificate della proteina, ottenute secondo protocolli già sperimentati presso il nostro laboratorio, saranno sottoposti a digestione proteolitica in vitro con enzimi diversi ed in condizioni diverse per verificarne la suscettibilità. Come anticipato, si valuteranno gli effetti del pH, della forza ionica, della concentrazione proteica e della presenza o meno di fattori stabilizzanti e destabilizzanti. Le stesse condizioni operative verranno impiegate parallelamente per studi di "dynamic light scattering" (DLS), con una strumentazione già disponibile presso il nostro laboratorio. Queste prove consentiranno di stabilire lo stato di associazione della proteina nelle diverse condizioni. Con questi studi spettroscopici sarà possibile determinare il grado di polimerizzazione della proteina ed inoltre in che misura esso sia mediato da formazione/scambio di disolfuri, la cui presenza nella proteina è garantita da 12 residui di cisteina. Queste ricerche parallele permetteranno di correlare la suscettibilità alla proteolisi della proteina con il suo stato di associazione, consentendo di formulare ipotesi sui requisiti ottimali per il manifestarsi della attività biologica della proteina nonché sul suo stato nelle condizioni di transito ed assorbimento gastro-intestinale. [1] C. Magni, F. Sessa, E. Accardo, M. Vanoni, P. Morazzoni, A. Scarafoni, M. Duranti J. Nutr. Biochem. (2004), 15:646-650.