Nostri studi (1) hanno evidenziato che in A. vinelandii RhdA, una tandem-domain rodanesi con peculiare sito attivo, può funzionare da scavenger di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Allo scopo di convalidare l'idea che le proteine a rhodanese-domains abbiano "adattato" le loro funzioni in processi metabolici e regolatori distinti, e che riconoscimenti molecolari e interazioni biologiche siano direzionati dalla struttura del sito attivo, utilizzeremo il "modello" Escherichia coli. E. coli infatti è il prototipo di organismo che contiene tutte le "architetture" di proteine rhodanese-like, ma non una col sito attivo di RhdA. Tra le 9 E. coli rhodanese-domain proteine, SseA già caratterizzata da nostri studi (2,3) rappresenta il prototipo di tandem-domain rhodanese-like con in vitro attività 3-mercaptopiruvato solfotransferasica (MST). Ci proponiamo dunque di definire il fenotipo del mutante, che selettivamente non esprime SseA già costruito nel nostro lab, cercando condizioni di crescita che in E. coli esaltino gli effetti dell'assenza di SseA (e.g. crescita su fonti di carbonio diverse, condizioni di stress ossidativo chimicamente provocato). Coniugando approcci di proteomica (2-DE) e analisi di profili enzimatici ci aspettiamo di identificare spot proteici differentemente "regolati" in funzione della presenza (wild-type) o dell'assenza (E. coli "delta"sseA) di SseA. La possibilità di over-esprimere SseA nel sistema omologo E. coli sarà sfruttata per esaltare le sue eventuali funzioni in condizioni metaboliche specifiche allo scopo di ottenere un quadro comparativo con gli "effetti" verificati in A. vinelandii in conseguenza della deficienza di RhdA, la rhodanese-like proteina che si differenzia per la peculiarità del loop del sito attivo (4).
1- Cereda, A., Carpen, A., Picariello, G., Iriti, M., Faoro, F., Ferranti, P., Pagani, S. Effects of the deficiency of the rhodanese-like protein RhdA in Azotobacter vinelandii.(2007) FEBS Letters 581, 1625-1630.
2- Colnaghi, R., Cassinelli, G., Drummond, M., Forlani, F., Pagani, S. Properties of the Escherichia coli rhodanese-like protein SseA: contribution of the active-site residue Ser240 to sulfur donor recognition.(2001) FEBS Letters 500, 153-156.
3- Spallarossa, A., Forlani, F., Carpen, A., Armirotti, A., Pagani, S., Bolognesi, M., Bordo, D. The "Rhodanese" fold and catalytic mechanism of 3-mercaptopyruvate sulfurtransferases: crystal structure of SseA from Escherichia coli.(2004) J. Mol. Biol. 335, 583-593.
4- Bordo D., Deriu D., Colnaghi R., Carpen A., PaganiS., Bolognesi M. The crystal structure of a sulfurtransferase from Azotobacter vinelandii highlights the evolutionary relationship between rhodanese and phosphatase enzymes family.(2000) J. Mol. Biol. 298, 691-704.