La ferredossina-NADP+ riduttasi di Plasmodium falciparum: studio del meccanismo catalitico e della inibizione di un potenziale bersaglio di nuovi farmaci antimalarici

La malaria rappresenta tuttora un'emergenza sanitaria a livello mondiale, causando milioni di vittime per anno, soprattutto nell'Africa sub-sahariana. I principali limiti delle terapie antimalariche oggi disponibili sono rappresentati da fenomeni di resistenza. Per questa ragione è urgente lo sviluppo di nuovi farmaci antimalarici, attivi attraverso nuovi meccanismi d'azione. Le attuali conoscenze della biologia di Plasmodium falciparum indicano nell'apicoplasto un importante determinante della virulenza del protozoo parassita. Tale organulo può essere considerato un plastidio non fotosintetico ed è sede di vie metaboliche essenziali. Abbiamo dimostrato che la ferredossina-NADP+ riduttasi (PfFNR) localizzata nell'apicoplasto è in grado di fornire elettroni a LytB, un enzima della via biosintetica degli isoprenoidi e, su tale base, abbiamo proposto che la PfFNR possa rappresentare un bersaglio molecolare di composti attivi come antimalarici. Abbiamo sovraprodotto con successo la PfFNR e la sua proteina partner ferredossina (PfFd) in E. coli. Le due proteine sono state caratterizzate in dettaglio dai punti di vista funzionale e strutturale, ottenendone tra l'altro anche la struttura cristallografica. Nell'ambito di questo programma saranno svolte le seguenti attività: 1) Studio del meccanismo catalitico della PfFNR, con particolare riguardo all'interazione con i suoi susbstrati NADP(H) e PfFd mediante tecniche di mutagenesi sito-diretta, cinetica enzimatica, spettroscopia e cristallografia ai raggi-X. Con questi approcci sarà definito il ruolo di singoli residui amminoacidici nella catalisi. 2) Identificazione e progettazione razionale di inibitori della PfFNR in base ai risultati degli studi indicati al punto 1. La disponibilità della struttura 3D dell'enzima permetterà la selezione di potenziali inibitori mediante screening in silico di librerie virtuali di composti. I ligandi più promettenti saranno saggiati in vitro sia sulla PfFNR purificata sia su parassiti in coltura. Dei composti identificati come inibitori saranno determinati i valori di IC50, il meccanismo e le costanti di inibizione (Ki). Questo approccio ha già permesso di identificare ligandi di PfFNR con Ki in ambito sub-micromolare. 3) Si cercherà di ottenere la struttura cristallografica dei complessi della PfFNR con alcuni inibitori, allo scopo di costituire le basi per la progettazione di molecole modificate più potenti e selettive.