Caratterizzazione e utilizzo di un saggio citofluorimetrico di inibizione dell'entrata virale (HIV, Influenza, ...) mediante vettori lentivirali pseudotipizzati con proteine dell'involucro

La tecnologia dei vettori lentivirali (derivati da HIV) pseudotipati con proteine dell'involucro (env) derivate da una vasta gamma di virus differenti (VSV, HIV, Influenza...) pemette di valutare l'inibizione dell'entrata virale in una cellula ospite con un saggio omogeneo di citofluorimetria. I vettori pseudotipati infettano le cellule ospiti e si integrano nei cromosomi esprimendo una proteina fluorescente (rossa o verde), ma non portano alcun gene virale, e non danno luogo ad alcuna progenie virale. Per questo motivo sono utilizzabili in condizioni di sicurezza P2 e non richiedono alti livelli di contenimento biologico. Nel saggio proposto, le cellule (linfociti dal sangue periferico o linee coltivate in vitro) vengono infettate da una miscela di due vettori, uno di controllo (pseudotipato con la env di VSV, che esprime una proteina rossa) e un secondo virus pseudotipato con la env del virus da inibire (HIV, influenza...), che esprime una proteina verde. Le quantità relative dei due virus da usare nell'infezione mista vengono scelte in modo che si abbiano, circa, il 5% di cellule infettate verdi e il 5% di cellule infettate rosse (la bassa moi è necessaria per evitare doppie infezioni e interferenze tra i due virus). Un inibitore selettivo (che inibisca , per esmpio, HIV ma non VSV) causerà un cambiamento del rapporto tra cellule infettate rosse e verdi. Il vantaggio di questo saggio sugli altri diponibili è che è omogeneo, cioè consiste in una singola infezione (mista) seguita da un unica misura al citofluorimetro che confronta direttamente l'incognita sperimentale con il controllo. Il ventaglio di inibizioni studiabile con questo saggio è molto ampio: anticorpi, peptidi distruttivi, agonisti, antagonisti, silenziamento mediante siRNA di geni cellulari necessari al processo di entrata... In particolare, il saggio sarà messo a punto su inbitori noti, quali l'anticorpo 2F5 (reattivo con un epitopo neutralizzabile di HIV gp41) e il Peptide T20 (Enfurtivide) e sul silenziamento mediante siRNA di CD4, o di HLA-C. In seguito, il saggio sarà utilizzato per cercare nuovi peptidi o anticorpi (da librerie fagiche) inibitori l'entrata di HIV-1 o del virus dell'influenza aviaria H5N1.