L'espansione della diversità dei microRNA (miRNA) nei vertebrati sembra aver svolto un ruolo chiave nell'incremento della diversità fenotipica e della complessità dei vertebrati rispetto ad altri organismi animali come i protostomi. Infatti, recenti studi hanno rivelato una stretta correlazione tra innovazione dei miRNA e incremento della complessità dello sviluppo nei metazoi. Data l'importanza dei miRNA nei processi di sviluppo nei vertebrati, risulterebbe molto interessante uno studio sistematico e una comparazione della diversità e della funzione dei miRNA tra vertebrati e cordati basali, come ascidie e anfiosso. Tale studio consentirebbe sia di ampliare le conoscenze sui meccanismi di evoluzione dei miRNA che di comprendere le differenze sostanziali tra il programma di sviluppo di vertebrati e cordati basali.
Lo scopo di questo progetto è lo studio della diversità e della funzione dei miRNA in cordati basali quali anfiosso (cefalocordato), Ciona intestinalis e Ciona savignyi (tunicati, ascidie), tutte specie-modello il cui genoma nucleare è stato completamente sequenziato. Tale studio sarà compiuto adoperando un approccio integrato computazionale e sperimentale: putativi miRNA saranno identificati attraverso metodiche computazionali sviluppate ad hoc; miRNA maturi saranno identificati attraverso deep-sequencing della frazione di RNA di piccole dimensioni, usando la piattaforma SOLEXA e oligonucleotide-array. L'analisi del genoma di due specie cogeneriche di ascidie dovrebbe facilitare l'identificazione dei miRNA attraverso metodiche comparative.
Per il raggiungimento degli obiettivi del progetto si procederà a:
1) l'utilizzo di metodi computazionali già disponibili, come RNAfold e RNAlfold, al fine di identificare regioni genomiche che, se espresse, siano in grado di formare strutture secondarie simili a potenziali precursori di miRNA;
2) lo sviluppo di una Support Vector Machine (SVM) in grado di discriminare probabili miRNA da strutture hairpin spurie;
3) l'analisi comparativa dei putativi miRNA identificati nelle due specie di Ciona;
4) il disegno di array oligonucleotidici per esaminare il pattern di espressione dei potenziali miRNA tramite una piattaforma Combimatrix;
5) deep-sequencing (piattaforma Solexa) della frazione di RNA piccoli di Ciona intestinalis per identificare piccoli RNA espressi potenzialmente corrispondenti a miRNA. Gli RNA identificati saranno mappati sul corrispondente genoma al fine di validare i miRNA predetti per via computazionale. La validazione dei miRNA di C. intestinalis consentirà quindi di verificare l'efficienza e l'accuratezza della metodologia di predizione di miRNA messa a punto, ed eventualmente di migliorarla modificandone opportunamente alcune caratteristiche.
6) il confronto del numero, del tipo e del livello di conservazione dei miRNA identificati in cordati basali rispetto a quelli annotati in vertebrati e alcuni organismi-modello invertebrati.