ATTIVAZIONE DI p38 MAPK NELLE CELLULE THP-1 PER IDENTIFICARE E CLASSIFICARE LE SOSTANZE ALLERGENICHE

PRESUPPOSTI. Attualmente la valutazione del potenziale allergenico delle sostanze chimiche viene fatta utilizzando modelli animali. Nell'ultimo decennio, diversi metodi in vitro sono stati proposti per identificare gli allergeni da contatto al fine di ridurre l'uso degli animali nella valutazione tossicologica. La maggior parte di questi metodi utilizza colture primarie di cellule dendriche ottenute da donatori sani.Le principali limitazioni di questo approccio sono la variabilità della risposta dovuta all'uso di donatori diversi e la possibile mancanza di donatori. Recentemente il nostro laboratorio ha dimostrato un rilascio selettivo di interleuchina-8 o CXCL8 (IL-8) da parte degli allergeni nella linea cellulare THP-1 e che tale rilascio è legato all'attivazione di p38 MAPK. Attraverso l'analisi Western blot, abbiamo dimostrato l'attivazione precoce (15 min) di p38 MAPK da parte di tutti gli allergeni testati e, mediante l'uso di un inibitore selettivo di p38 MAPK, una modulazione significativa del rilascio di IL-8 (48 ore), indicando una comune via di attivazione intracellulare. SCOPO DEL LAVORO. Il presente progetto di ricerca si prefigge di: 1) sviluppare un test rapido di screening del potenziale allergenico sulla base dell'attivazione selettiva da parte degli allergeni di p38 MAPK e 2) valutare la possibilità di classificare la potenza allergenica in base all'entità dell'attivazione di p38 MAPK e del rilascio di IL-8. DISEGNO SPERIMENTALE.Le cellule THP-1 saranno trattate con diversi allergeni e l'attivazione di p38 MAPK sarà valutata dopo 15 min mediante analisi Western blot e, parallelamente, un metodo citofluorimetrico per misurare l'attivazione di p38 MAPK (più quantitativo e meno laborioso rispetto all'analisi Western blot) verrà messo a punto. Il rilascio di IL-8 nel medium di coltura verrà invece valutato dopo 48 ore di incubazione mediante dosaggio immunoenzimatico. Composti non allergenici verranno utilizzati per confermare la specificità del metodo proposto. Per la valutazione della potenza i dati ottenuti in vitro verranno confrontati con i dati in vivo di EC3, ottenuti tramite il saggio del linfonodo locale e disponibili in letteratura, al fine di evidenziare la loro correlazione. In particolare verranno testate le seguenti sostanze: benzochinone (sensibilizzante estremo, EC3= 0.0099%), 2-amminofenolo (sensibilizzante forte, EC3= 0,4%), isoeugenolo (sensibilizzante moderato, EC3= 1,2%), dietilmaleato (sensibilizzante moderato, EC3= 5,8%), citrale (sensibilizzante debole, EC3= 13%) e imidazolin urea (sensibilizzante debole, EC3= 24%), mentre l'acido lattico e il glicole propilenico verranno utilizzati come agenti non sensibilizzanti. RISULTATI ATTESI. Sviluppo di un metodo rapido di screening in vitro per caratterizzare il potenziale allergenico delle sostanze chimiche e di classificazione della loro potenza allergenica.