Identificazione di substrati proteici ed effettori finali regolati da HD-PTP utilizzando un approccio proteomico in cellule di carcinoma della vescica

Il carcinoma transizionale della vescica (TCC) è il cancro più comune del tratto urinario ed è originato dal normale epitelio transizionale stratificato della vescica. Il gene hd-ptp mappa sul cromosoma 3p21.3, una regione frequentemente deleta in forme invasive del carcinoma della vescica. Inoltre, HD-PTP di ratto sopprime la trasformazione mediata da Ha-Ras, un oncogene coinvolto nella progressione del carcinoma della vescica. Noi abbiamo dimostrato che HD-PTP sopprime la motilità di cellule di carcinoma della vescica interagendo con c-src e FAK suggerendo che HD-PTP potrebbe agire come oncosoppressore. In questo progetto ci proponiamo di studiare il ruolo di HD-PTP nella progressione del carcinoma della vescica valutando quali sono i suoi substrati e quali proteine regola all¿interno della cellula. In particolare, prevediamo di usare un approccio proteomico per identificare: (Parte 1) proteine il cui stato di fosforilazione è modulato da HD-PTP e (Parte 2) nuove proteine che interagiscono con HD-PTP. In esperimenti preliminari abbiamo inibito la traduzione di HD-PTP in cellule T24 di carcinoma della vescica utilizzando un siRNA stabile ottenendo il clone T24-¿s1, senza HD-PTP, e il clone controllo (T24-C) che esprime HD-PTP. Per la Parte 1, noi prepareremo degli estratti proteici da cellule T24-as1 e T24-C, quindi immunoprecipiteremo gli estratti con un anticorpo anti-fosfotirosina e separeremo le proteine su un gel bidimensionale 2D-PAGE. Per mezzo della tecnica dell¿impregnazione argentica le proteine fosforilate in tirosina saranno evidenziate come macchie nere e una procedura computerizzata analizzerà l¿intensità differenziale della fosforilazione nei due campioni, con o senza HD-PTP. Le proteine corrispondenti ai segnali scelti saranno estratte dal gel e analizzate con spettrometria di massa (MS/MS). Queste tecniche permetteranno di ottenere la sequenza N-terminale e l¿identità della proteina corrispondente al segnale di fosforilazione individuato. Gli esperimenti descritti non sono in grado di discriminare tra le proteine defosforilate direttamente da HD-PTP e le altre proteine cellulari che sono regolate indirettamente più a valle nella cascata di trasduzione del segnale. Risulta quindi di primaria importanza individuare le proteine che sono in grado di interagire direttamente con HD-PTP. Nella Parte 2 useremo cellule T24 trasfettate stabilmente con un vettore che esprime una proteina HD-PTP ricombinante fusa con una sequenza S-tag. L¿estratto proteico sarà purificato su una resina specifica per l¿S-tag e separato su un 2D-PAGE. I segnali presenti nel campione S-tag-HD-PTP e assenti nel controllo trasfettato con il vettore vuoto rappresentano le proteine legate a HD-PTP. Questi saranno estratti dal gel e identificati. La sovrapposizione dei risultati della Parte 1 e 2 migliorerà la comprensione del ruolo di HD-PTP nella progressione del carcinoma della vescica, evidenziando substrati diretti ed effettori indiretti della proteina.