Problema e dello scopo generale della ricerca
I recettori purinergici P2X comprendono sette sottotipi (1-7) e sono correlati all¿apertura di canali ionici delle membrane cellulari, favorendo la mobilizzazione di calcio ed i conseguenti eventi fisiologici. Tali recettori sono in grado di legarsi all¿ATP extracellulare, qualora venga rilasciato dalle cellule danneggiate o in fase di necrosi. In particolare, il recettore P2X7 è espresso nell¿uomo su alcune cellule, quali cellule dendritiche, linfociti T, macrofagi e monociti. L¿attivazione dei recettori P2X7 localizzati sui macrofagi provoca apoptosi ATP-mediata delle stesse cellule. L¿ATP extracellulare regola la funzionalità delle cellule endoteliali attraverso alcuni dei recettori purinergici P2X, in modo autocrino e paracrino; tuttavia non è ancora stato definito nulla di preciso sulla presenza e sulla modulazione dell¿espressione dei recettori P2X7 per ATP (P2X7R) sulle cellule endoteliali umane.
Lo scopo della ricerca è quello di correlare in vitro l¿espressione endoteliale dei P2X7R con l¿attivazione e/ quiescenza delle cellule endoteliali, in presenza o assenza di citochine, e di indagare tale espressione in vivo in condizioni fisiologiche e/o patologiche.
Materiali e Metodi
Le HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) verranno isolate da cordone ombelicale umano mediante trattamento con collagenasi e coltivate in fiasche ricoperte di gelatina all¿1% utilizzando medium 199 contenente il 20% di siero bovino fetale inattivato al calore, l¿1% di fattore di crescita derivato dalla retina bovina, 90 microg/ml di eparina, 100 UI/ml di penicillina e 100microg/ml di streptomicina. Come citochine attivanti verranno utilizzate TNF alfa e IL-1.
Verranno altresì analizzate le cellule endoteliali ottenute da porzioni di arterie o vene prelevate nel corso di interventi chirurgici.
L¿attivazione endoteliale verrà così valutata: Con analisi citofluorimetrica verranno analizzate: l¿espressione da parte delle HUVEC delle molecole di adesione ICAM-1, VCAM-1, VE-caderine e dei recettori per TNF alfa (i campioni verranno analizzati al FACScan con il supporto di un software CELLQuest). La vitalità cellulare verrà testata con il metodo MTT(3-(4,5 dimetil Tiazol-2-il)-2,5-dimetiltetrazolio bromide: il sale tatrazolico solubile in acqua, se metabolizzato dalle cellule, viene trasformato in un formazano insolubile in acqua, la cui assorbanza verrà misurata spettrofotometricamente. L¿apoptosi e l¿attività mitocondriale verranno valutate con il microscopio a fluorescenza (colorazione con annessina V coniugata con fluorescina e colorazione con Mitotraker Red CMXRos, rispettivamente). L¿espressione dei P2X7R verrà valutata utilizzando il microscopio confocale.
Obiettivo specifico
1) Correlare l¿espressione di P2X7 con lo stato di attivazione dell¿endotelio e la loro associazione con alcune patologie vascolari (aterosclerosi, diabete)
2) Individuare P2X7 come possibile ¿target¿ di trattamenti farmacologici.