CONFRONTO TRA SISTEMI DI CRIOCONSERVAZIONE DI OVOCITI IMMATURI UTILIZZABILI NELLA RICOSTRUZIONE DI OVOCITI ARTIFICIALI MEDIANTE TRASFERIMENTO DELLA VESCICOLA GERMINALE

Questo studio si propone di paragonare due diverse tecniche di crioconservazione da applicare ad ovociti di bovino allo stadio di vescicola germinale (GV) al fine di assicurare la maggiore efficienza e ripetibilità nella ricostruzione di ovociti artificiali mediante la tecnica del trasferimento della vescicola germinale (GVT). Complessi ovocita-cumulo ooforo, isolati da ovaie provenienti da animali macellati verranno privati delle cellule del cumulo ooforo come precedentemente indicato (Luciano et al., 2005 Mol Reprod Dev 71: 389-397) e sottoposti a congelamento rapido mediante vitrificazione con la tecnica delle ¿open pulled straw¿ (Modina et. al. 2004, Eur J Hist, 48:337-46) od a congelamento lento (Luvoni et al., 2000, Theriogenology 53:1529-40). Dopo scongelamento, gli ovociti provenienti da entrambe le metodiche di congelamento verranno equilibrati per 30 minuti a 38.5°C in M199 addizionato del 10% di siero bovino, quindi sottoposti a manipolazione per il trasferimento eterologo della GV come precedentemente indicato (Luciano et al., 2006 Repr Fert Dev 18:138). Brevemente, da ciascun ovocita verrà rimossa la GV con una modesta quantità di citoplasma (carioplasto) e trasferita nello spazio perivitellino di un altro ovocita precedentemente enucleato (citoplasto). Gli ovociti, ricostruiti mediante elettrofusione, verranno sottoposti a maturazione in vitro come precedentemente indicato (Luciano et al., Mol Reprod Dev 2005:71 389-97). Al termine della coltura, parte di essi verrà poi destinata all¿analisi dell¿organizzazione del citoscheletro (Modina et al., Eur J Histochem 2004:48 337-46) ed alla valutazione dell¿efficienza di maturazione mentre un¿altra parte verrà sottoposta ad attivazione partenogenetica per valutarne la capacità di sviluppo embrionale. I risultati di questa ricerca potranno fornire importanti indicazioni sull¿idoneità dei protocolli di crioconservazone attualmente in uso nel preservare l¿integrità citoplasmatica e nucleare di ovociti allo stadio di GV e destinabili alle procedure di ricostruzione di ovociti mediante trapianto del nucleo in un nuovo citoplasma. Inoltre potranno contribuire allo sviluppo di programmi di riproduzione assistita e salvataggio del germoplasma, sia in ambito zootecnico che umano.