MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION: APPLICAZIONE PER L¿IDENTIFICAZIONE DI DELEZIONI E RIARRANGIAMENTI DEI GENI GLOBINICI NELLE SINDROMI TALASSEMICHE ATIPICHE.

Le sindromi talassemiche sono un gruppo di emoglobinopatie ereditarie caratterizzate da una riduzione di entità variabile o dalla totale assenza di sintesi di una o più catene globiniche. Le beta-talassemie sono provocate principalmente da mutazioni puntifomi o da piccole delezioni all¿interno del gene beta-globinico e nelle sue sequenze fiancheggianti. Delezioni e riarrangiamenti all¿interno del cluster beta-globinico (cromosoma 11p15.5) costituiscono circa il 10% delle mutazioni responsabili di beta-talassemia e di HPFH (Hereditary Persistance of Fetal Hemoglobin). Le alfa-talassemie al contrario, sono determinate per l¿80% da delezioni che coinvolgono il cluster alfa-globinico e gli elementi che ne regolano l¿espressione (cromosoma 16p13.3). I metodi comunemente utilizzati per l¿analisi e la caratterizzazione dei clusters dei geni globinici (gap-PCR, Southern blot e analisi di FISH), non sempre sono sufficienti ed efficaci al fine di una corretta diagnosi. Circa il 10% dei fenotipi talassemici rimangono orfani di diagnosi molecolare. L¿obiettivo di questo lavoro è quello di: 1. utilizzare nuove strategie per l¿identificazione di delezioni e riarrangiamenti cromosomici in pazienti affetti da talassemia nei quali le tecniche convenzionali non siano state in grado di rilevare alterazioni molecolari. 2. individuare i breackpoints responsabili di nuove delezioni in modo da ampliare le conoscenze dei meccanismi alla base di queste alterazioni genetiche. Recentemente è stata descritta una nuova metodica, per l¿identificazione di estese delezioni e duplicazioni di sequenza chiamata MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Questa tecnica è basata sulla identificazione del numero di copie alleliche mediante amplificazione di sonde ibridate specificatamente al DNA di interesse. L¿MLPA verrà applicata nello studio dei cluster alfa e beta-globinici su tutti i pazienti affetti da talassemia atipica e riferiti al Centro Anemie Congenite della Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico. La caratterizzazione dei breackpoints sarà eseguita successivamente mediante long PCR, sequenziamento diretto e chromosome walking.