Studio dell¿inibizione delle deacetilasi istoniche embrionali come meccanismo alla base delle malformazioni indotte nel topo da acido salicilico.

Le malformazioni allo scheletro assile sono frequentemente correlate ad esposizione in gravidanza a xenobiotici. Possono essere classificate come fusioni (tra vertebre, tra coste, tra coste e vertebre), duplicazioni e respecificazioni omeotiche (i segmenti coinvolti assumono la morfologia di segmenti adiacenti). Nonostante il meccanismo che porta a tali anomalie non sia ancora noto, l¿espressione anomala dei geni che determinano la specificazione dei somiti (organi assili embrionali transitori) è considerata rilevante. Il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente dimostrato una correlazione diretta tra malformazioni assili nei feti e iperacetilazione istonica nei somiti di embrioni di topo esposti in utero ad inibitori delle deacetilasi istoniche (acido valproico, tricostatina A, acido butirrico, apicidina, MS-275). Gli istoni sono proteine nucleari associate al DNA. Lo stato di acetilazione delle code istoniche è uno dei fattori coinvolti nella regolazione del compattamento della cromatina ed è controllato da enzimi a funzione contrapposta: le acetiltransferasi (HAT) e le deacetilasi istoniche (HDAC), che, regolando il passaggio da etero- ad eu-cromatina, controllano indirettamente l¿espressione genica. Gli inibitori delle HDAC sono legati in cellule tumorali alla incorretta regolazione dell¿espressione genica. Recentemente, è stato dimostrato dal nostro gruppo di ricerca che le malformazioni allo scheletro assile indotte da acido borico (molecola che non è mai stata classificata come inibitore delle HDAC) sono correlate a iperacetilazione istonica a livello dei somiti, e che acido borico è un inibitore delle deacetilasi istoniche sia in lisati cellulali HeLa che in omogenati embrionali. Scopo del presente lavoro è lo studio della possibile correlazione tra le malformazioni assili indotte da acido salicilico (molecola ad oggi non considerata come inibitore delle HDAC, nota tuttavia per indurre questo tipo di anomalie attraverso un meccanismo ad oggi non noto), iperacetilazione istonica a livello dei somiti, inibizione delle HDAC in lisati embrionali. Femmine gravide di topo saranno trattate per via intraperitoneale con dosi crescenti non tossiche per le madri di sodio salicilato l¿8° giorno di gestazione (stadio embrionale E8, corrispondente a circa 5 somiti). Alcune femmine saranno sacrificate dopo 1, 3 o 5 ore dopo il trattamento, gli embrioni verranno prelevati e processati per la immunocolorazione o il western blot. Per entrambe le metodiche si utilizzeranno anticorpi anti-istone H4 iperacetilato, anti-lisina acetilata o anti-actina (come proteina di riferimento). Le restanti femmine saranno sacrificate a termine di gravidanza (E18), i feti verranno prelevati e processati per la doppia colorazione dello scheletro, al fine di evidenziare sia il tessuto osseo che cartilagineo. Per valutare l¿attività enzimatica, si utilizzeranno estratti nucleari di cellule HeLa o di embrioni di topo non trattati, espiantati all¿8° giorno di gestazione.