Sviluppo di un metodo in LC/MS per la determinazione quantitativa e simultanea delle microcistine

Le microcistine sono una famiglia di epatotossine prodotte principalmente da cianobatteri (alghe azzurre) che appartengono ai generi Microcystis, Oscillatoria, Anabaena e Nostoc (1). I cianobatteri sono organismi procarioti che presentano un¿alta diversificazione morfologica, documentata dalla presenza di generi con morfologia unicellulare, filamentosa, ramificata e non. Questi microrganismi fotoautrotofi sono capaci di colonizzare una grande varietà di ambienti (ghiacciai, deserti, ambienti ipersalini e termali) ma il maggior numero di specie si trova nelle acque dolci. I generi maggiormente presenti nei laghi italiani sono rappresentati da Plantotrix, Aphanizomenon, Anabaena e Microcystis aeruginosa. I cianobatteri sono in grado di produrre più di 50 varianti strutturali di microcistine, che sono caratterizzate chimicamente da una comune struttura eptapeptidica ciclica, contenente due L-aminoacidi variabili, due D-aminoacidi, e tre aminoacidi inusuali. Le microcistine più abbondantemente presenti in natura sono la microcistina-LR, la microcistina-RR e la microcistina-YR. Questi composti sono dei potenti epatotossici, anche a basse concentrazioni, attraverso l¿inibizione della attività delle fosfatasi epatiche, cui consegue una distruzione del citoscheletro e massive emorragie (2). La presenza di microcistine è associata alla produzione di blooms di cianobatteri a seguito dei fenomeni di eutrofizzazione delle acque. In tali evenienze può evidenziarsi una elevata mortalità dei pesci o un accumulo delle tossine lungo la catena alimentare acquatica costituendo un rischio per il consumatore. La popolazione umana è molto esposta al rischio di ingestione di microcistine, principalmente attraverso l¿acqua o alimenti contaminati. In risposta alla sempre più emergente problematica, l¿OMS ha stabilito livelli tollerabili per l¿acqua di 1 ng ml-1 di microcistina-LR. Scopo della presente ricerca sarà quello di mettere a punto un metodo di analisi in LC/MS per la determinazione quantitativa e simultanea delle microcistine nelle acque, nei blooms algali e nei tessuti degli organismi acquatici (molluschi, crostacei e pesci). Verrà utilizzato un sistema LC/MS costituito da un cromatografo liquido (Alliance, Waters) accoppiato ad uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (Quattro Premier XE, Micromass), munito di interfaccia ESI e APCI. Il metodo prevederà l¿estrazione dei principi attivi dalle matrici mediante solventi organici e successiva analisi in LC/MS. Saranno ottimizzate le condizioni separative in LC e le condizioni di ionizzazione in elettrospray. Verranno calcolati accuratezza e precisione del metodo e misurato il recupero dei composti dalle matrici mediante l¿impiego di materiali di riferimento certificati. Il metodo sarà poi applicato ad alcuni campioni di acque, alghe ed alimenti per valutarne robustezza e praticità. Bibliografia: (1) Codd G.A. et al. Eur. J. Phycol. (1999), 34, 405-415; (2) Dawson R.M. Toxicon (1998), 36(7), 953-962.