IL FATTORE DI CRESCITA EPATICO (HGF) CAUSA OPPOSTA REGOLAZIONE DI CXCR4 IN TUMORI MAMMARI AD ALTA ED A BASSA INVASIVITA`: ANALISI DEI MECCANISMI MOLECOLARI COINVOLTI NELLA DIFFERENTE RISPOSTA

PRESUPPOSTI: Abbiamo dimostrato che il fattore di crescita epatico (HGF) induce il recettore per chemochine CXCR4 in cellule di tumore mammario a bassa invasività (MCF-7). Al contrario in cellule ad alta invasività (MDA-MB231) l¿espressione di CXCR4 dopo HGF è ridotta. Scopo- Visto il ruolo di HGF nel microambiente del tumore, come regolatore del fenotipo neoplastico, e di CXCR4 sulle cellule tumorali, nel controllo di diverse fasi del processo metastatico, riteniamo interessante approfondire i meccanismi molecolari responsabili della diversa risposta ad HGF. La conoscenza delle vie di segnale e dei fattori trascrizionali, coinvolti nella espressione di CXCR4, potrebbe infatti chiarire l¿influenza di HGF sul comportamento invasivo/metastatico delle cellule tumorali. DESCRIZIONE: Le due linee di cellule tumorali verranno trattate con HGF ricombinante umano, ad una concentrazione nota attivare il recettore Met. Si studierà l¿attivazione di Src per fosforilazione, uno dei principali trasduttori del segnale di HGF/Met, e delle chinasi a valle, PI3K/Akt e ERK1/2, tramite Western blot. Inoltre, utilizzando inibitori chimici o dominanti negativi, si valuterà il coinvolgimento di queste chinasi nell¿attività del promotore di CXCR4 (-2632/+86)Luc in esperimenti di transfezione transitoria. Considereremo se uno dei punti critici di divergenza dei meccanismi di controllo sia a livello della attivazione dell¿istone deacetilasi 3 (HDAC3), caratteristicamente associato alla membrana cellulare e possibilmente substrato di Src: verrà effettuata una analisi confocale dopo reazione con anticorpi fluorescenti specifici per fosfoSrc, HDAC3 e fosfo-tirosina (indice di attivazione di HDAC3 da parte di Src). Siccome gli HDAC regolano l¿espressione genica, valuteremo l¿attività di Ets1 e NF-kB, due fattori trascrizionali chiave per l¿espressione di CXCR4; per questo saranno condotti esperimenti di gel-shift. La diversa espressione genica di CXCR4 in risposta ad HGF sarebbe compatibile con l¿opposta regolazione dei due fattori trascrizionali: l¿eventuale inibizione di Ets1 e NF-kB potrebbe dipendere dalla attività di HDAC3 come corepressore. OBIETTIVO: Con questi studi si intende evidenziare se ci siano particolari eventi epigenetici, quale deacetilazione degli istoni, indotti da HGF; questi sarebbero importanti per la crescita invasiva dei tumori e potrebbero essere diversamente attivi in cellule neoplastiche ad alto e basso grado di invasività. A livello epigenetico si esercita un importante controllo sulla trascrizione e sul fenotipo neoplastico. Pensiamo di chiarire alcuni aspetti dell¿¿homing¿ di cellule di carcinoma mammario altamente invasive. Infatti cellule come le MDA-MB231 metastatizzano in siti specifici (linfonodi, ossa), dove è prodotto il ligando per CXCR4 responsabile della migrazione preferenziale; HGF presente nel microambiente del tumore, riducendo trascrizionalmente il livello di CXCR4, favorirebbe la ritenzione in questi siti.