Differenziamento neuronale di Staminali Embrionali Umane per la produzione di modelli cellulari di Malattia di Huntington

Nel campo delle malattie neurodegenerative vi è una urgente necessita¿ di modelli sperimentali di malattia che riproducano gli eventi causativi in cellule il piu¿ possibile simili a quelle colpite dal danno. L¿obiettivo di questo progetto di ricerca e¿ lo sviluppo di modelli cellulari innovativi per lo studio della Corea di Huntington, una malattia neurodegenerativa a carattere ereditario. Lo scopo è l¿ottenimento di un modello in vitro che riproduca le disfunzioni osservate in un contesto cellulare fisiologico adatto all¿identificazione di meccanismi patogenetici alla base della malattia, con lo scopo di individuare bersagli molecolari su cui intervenire. Negli ultimi anni, le ricerche del nostro laboratorio si sono estese allo studio delle linee di cellule staminali embrionali umane (hES) gia¿ messe in coltura, come consentito dalla attuale Legge 40/2004 e avendo ottenuto parere etico favorevole dal Comitato Etico dell¿Universita¿ degli Studi di Milano (Giugno 2005). Tra gli scopi principali vi è l¿ottenimento di cellule Neurali Staminali umane (cellule hNS, human Neural Stem cells) da cellule hES, adattando ed ottimizzando i protocolli sviluppati su cellule embrionali staminali di topo. Lo scopo è produrre una popolazione espandibile di cellule hNS che sia poi in grado di differenziare a neuroni maturi umani. Queste cellule, attualmente in fase di caratterizzazione, verranno ingegnerizzate per esprimere in modo stabile il gene responsabile della Malattia di Huntington e codificante per la proteina huntingtina. Produrremo cellule hNS esprimenti huntingtina mutata mediante trasfezione di costrutti esprimenti i primi N548aa di huntingtina umana mutata e in grado di generare tossicita¿ in cellule, come da precedenti risultati su cellule murine. Le stesse cellule verranno ingegnerizzate per ottenere linee che esprimano la proteina huntingtina normale. Diversi cloni stabili (con un massimo di cinque per ogni ingegnerizzazione) saranno selezionati, recuperati e analizzati per l¿espressione dei frammenti di huntingtina corrispondente mediante western blot e immunocitochimica. In una seconda fase sperimentale valuteremo il potenziale di staminalità dei nuovi modelli prodotti, cosi come il loro comportamento biologico e fenotipico. In particolare, analizzeremo l¿effetto dell¿huntingtina sana e mutata sulla trascrizione del gene del BDNF, precedentemente identificato come target dell¿huntingtina e la cui espressione è significativamente ridotta nella malattia. Valuteremo inoltre la capacità dei cloni prodotti di produrre una popolazione arricchita in neuroni maturi dopo differenziamento guidato. La raccolta giornaliera di cellule durante questo procedimento ci permetterà di valutare mediante immunocitochimica l¿espressione di marcatori neurali, neuronali e gliali, quali Tuj1, MAP2, NeuN, GAD65 e GFAP, per valutare la capacità dell¿huntingtina sana e mutata di controllare e guidare correttamente il committment e il differenziamento neuronale.