Ricostruzione 3D da proiezioni in tomografia elettronica: allineamento simultaneo di serie raccolte in geometria a doppio asse di tilt.

La nostra unità si occupa da diversi anni della ricostruzione 3D di strutture proteiche da mmagini proiezione riprese al microscopio elettronico ed ha messo a punto una vasta libreria di programmi originali per questo tipo di studi. Le ricerche sono state svolte in collaborazione con laboratori di microscopia elettronica all'avanguardia situati in USA, Germania, Spagna, Svizzera ed Italia (Siena). Le tecniche utilizzate riguardano sia lo studio ad alta risoluzione di complessi purificati (single particle analysis), sia lo studio di organuli subcellulari o proteine di membrane mediante "tomografia elettronica". Nella presente ricerca verranno condotti studi in collaborazione col dipartimento di Biologia Evolutiva dell'università di Siena per lo studio di componenti proteiche di rilevante interesse biologico. Si tratta di particelle IFT (Intra Flagellar Transport) responsabili del buon funzionamento di cilia e flagelli, componenti presenti in tutti gli animali. Ci proponiamo di studiare questi complessi "in situ", mediante ricostruzione 3D tomografica di porzioni di flagelli e successiva analisi dei complessi estratti dai tomogrammi. Per questo è necessario, prima di tutto, ottenere ricostruzioni tomografiche di ottima qualità. La tomografia elettronica si basa sugli stessi principi della TAC clinica, ma, per ragioni strumentali, non è possibile riprendere il campione da tutte le direzioni di vista. La geometria di ripresa più comune, tilt attorno ad un singolo asse, risulta forzatamente incompleta con conseguente anisotropia della risoluzione. Per migliorare la qualità si può raccogliere una seconda serie, ortogonale alla prima e combinare assieme i dati. In teoria la fusione dei dati è semplice, ma sorgono problemi causati dal danneggiamento del campione durante l'esposizione al fascio elettronico. In pratica il campione si modifica durante il corso di ciascuna serie e soprattutto tra una serie e l'altra. Queste modifiche non sono così gravi da invalidare l'esperimento, ma bisogna compensarle in fase di allineamento. Ci proponiamo quindi di sviluppare un algoritmo per l'allineamento simultaneo delle due serie, che tenga conto di tutte le deformazioni occorse. Le serie verranno raccolte a Siena su un microscopio Philips CM200 ed allineate a Milano. Una volta collezionato un numero sufficiente di ricostruzioni di buona qualità, procederemo allo studio delle particelle IFT. Le regioni contenti complessi IFT verranno estratte dai volumi, allineate tra loro e mediate per innalzare il rapporto segnale/rumore dei dati.