Premessa:
E¿ assodato che le specie reattive dell¿ossigeno (ROS), incluso l¿anione superossido (O2-), il radicale ossidrile (OH.) e l¿acqua ossigenata (H2O2), rivestono un ruolo fondamentale nella insorgenza e progressione di numerose condizioni patologiche accomunate da una risposta di tipo infiammatorio. I meccanismi attraverso cui i ROS attivano la risposta di tipi cellulari coinvolti in tale fenomeno è argomento di studio, anche se ormai sono numerose le evidenze che indicano come questi composti, oltre ad agire nel compartimento extracellulare con un ruolo di ¿killer¿, sono in grado di agire anche a livello intracellulare, influenzando, a livello di trascrizione, il profilo di espressione di geni rilevanti per la risposta infiammatoria. Tuttavia, gli studi che prendono in considerazione l¿effetto dei ROS nei confronti dell¿evento di riparazione che si verifica in conseguenza alla risposta infiammatoria sono sicuramente scarsi.
Obiettivo:
Sulla base delle considerazioni di cui sopra, la ricerca proposta ha come obiettivo quello di valutare l¿effetto che i ROS esercitano nei confronti della riparazione del danno endoteliale meccanicamente indotto e chiarire i mediatori ed i meccanismi di traduzione del segnale coinvolti in tale effetto. A tale scopo verranno utilizzati sia H2O2 (esogena e generata endogenamente da citochine proinfiammatorie) che donatori di specie radicaliche. Sulla base dei risultati ottenuti verrà studiato il coinvolgimento dell¿enzima NADPH ossidasi e dei vari componenti della catena mitocondriale. Inoltre ci si propone di esplorare i meccanismi molecolari che stanno alla base degli effetti mediati dai ROS in questo sistema sperimentale. In maggior dettaglio, si cercherà di chiarire il ruolo della cicloossigenasi inducibile (Cox-2) e dei suoi prodotti e di esplorare le principali vie di traduzione del segnale che sono coinvolte in questo tipo di fenomeno.
Metodi:
-Colture cellulari: cellule endoteliali umane isolate dalla vena del cordone ombelicale.
-Modello di monostrato cellulare meccanicamente danneggiato.
-Cicloossigenasi inducibile: determinata come proteina mediante analisi di Western, come attività enzimatica in termini di dosaggio di metaboliti dell¿acido arachidonico e come livelli di RNA messaggero, mediante RT-PCR.
-Fosforilazione di proteintirosinochinasi e MAP-chinasi: valutazione mediante analisi di Western.
-Attività della fosfatasi SHP-2: valutazione in seguito ad immunoprecipitazione