Obiettivi:
L¿obiettivo principale di questo progetto è di caratterizzare la popolazione di CSM residente nel miocardio. Gli obiettivi specifici sono i seguenti:
1) verificare l¿esistenza di una popolazione di cellule staminali con caratteristiche immunofenotipiche mesenchimali all'interno del cuore umano;
2) caratterizzare in vitro le proprietà funzionali delle CSM cardiache umane, confrontandole con CSM midollari derivate dallo stesso paziente;
3) confrontare la potenzialità rigenerativa delle CSM midollari e cardiache in vitro e in seguito ad iniezione in un modello murino di infarto del miocardio.
Materiali e Metodi:
1) Verificare l¿esistenza di una popolazione di cellule staminali con caratteristiche immunofenotipiche mesenchimali all'interno del cuore umano.
-Isolamento di CSM cardiache e midollari e analisi immunocitofluorimetrica.
CSM cardiache e midollari verranno isolate da frammenti di auricola umana ottenuta da pazienti sottoposti ad intervento di cardiochirurgia. Le cellule ottenute saranno selezionate sulla base delle loro proprietà di aderenza. Le cellule isolate verranno coltivate in diversi terreni per identificarne le migliori condizioni di crescita. L¿analisi immunofenotipica verrà effettuato mediante citofluorimetria.
2) Caratterizzare in vitro le proprietà funzionali delle CSM cardiache umane, confrontandole con CSM midollari derivate dallo stesso paziente
Poiché l¿immunofenotipizzazione delle CSM non è sufficiente per identificare le cellule staminali mesenchimali, verranno condotti studi volti a verificare la capacità differenziativa di tali cellule nel ¿lineare¿ osteogenico ed adipogenico.
3) Confrontare la potenzialità rigenerativa delle CSM midollari e cardiache in vitro e in seguito ad iniezione in un modello murino di infarto del miocardio.
Per valutare la capacità differenziativa delle CSM in cellule del ¿lineage¿ cardiaco, verranno condotti studi in vitro e in vivo.
a) Studi in vitro
Le CSM saranno coltivate in presenza di un terreno descritto in letteratura e capace di indurre la comparsa dei fenotipi endoteliale, cardiomiocitario e muscolare liscio su cellule c-kit+ isolate.
Il differenziamento verrà valutato mediante real Time RT-PCR ed immunofluorescenza.
b) Studi in vitro
In topi anestetizzati e ventilati verrà indotto l¿infarto del miocardio tramite legatura dell¿arteria coronaria sinistra. Le CSM cardiache e midollari verranno iniettate nella regione periinfartuale. Prima dell¿iniezione le cellule saranno infettate con un lentivirus codificante per la ¿Green Fluorescent Protein¿ (GFP) la cui espressione permetterà l¿identificazione delle cellule trapiantate nel tessuto cardiaco murino. Gli animali verranno sacrificati a 1, 2 e 3 settimane dopo la somministrazione delle CSC. Verranno effettuate le seguenti valutazioni: emodinamica, ecocardiografica ed immunoistochimica.
L¿obiettivo principale di questo progetto è di caratterizzare la popolazione di CSM residente nel miocardio. Gli obiettivi specifici sono i seguenti:
1) verificare l¿esistenza di una popolazione di cellule staminali con caratteristiche immunofenotipiche mesenchimali all'interno del cuore umano;
2) caratterizzare in vitro le proprietà funzionali delle CSM cardiache umane, confrontandole con CSM midollari derivate dallo stesso paziente;
3) confrontare la potenzialità rigenerativa delle CSM midollari e cardiache in vitro e in seguito ad iniezione in un modello murino di infarto del miocardio.
Materiali e Metodi:
1) Verificare l¿esistenza di una popolazione di cellule staminali con caratteristiche immunofenotipiche mesenchimali all'interno del cuore umano.
-Isolamento di CSM cardiache e midollari e analisi immunocitofluorimetrica.
CSM cardiache e midollari verranno isolate da frammenti di auricola umana ottenuta da pazienti sottoposti ad intervento di cardiochirurgia. Le cellule ottenute saranno selezionate sulla base delle loro proprietà di aderenza. Le cellule isolate verranno coltivate in diversi terreni per identificarne le migliori condizioni di crescita. L¿analisi immunofenotipica verrà effettuato mediante citofluorimetria.
2) Caratterizzare in vitro le proprietà funzionali delle CSM cardiache umane, confrontandole con CSM midollari derivate dallo stesso paziente
Poiché l¿immunofenotipizzazione delle CSM non è sufficiente per identificare le cellule staminali mesenchimali, verranno condotti studi volti a verificare la capacità differenziativa di tali cellule nel ¿lineare¿ osteogenico ed adipogenico.
3) Confrontare la potenzialità rigenerativa delle CSM midollari e cardiache in vitro e in seguito ad iniezione in un modello murino di infarto del miocardio.
Per valutare la capacità differenziativa delle CSM in cellule del ¿lineage¿ cardiaco, verranno condotti studi in vitro e in vivo.
a) Studi in vitro
Le CSM saranno coltivate in presenza di un terreno descritto in letteratura e capace di indurre la comparsa dei fenotipi endoteliale, cardiomiocitario e muscolare liscio su cellule c-kit+ isolate.
Il differenziamento verrà valutato mediante real Time RT-PCR ed immunofluorescenza.
b) Studi in vitro
In topi anestetizzati e ventilati verrà indotto l¿infarto del miocardio tramite legatura dell¿arteria coronaria sinistra. Le CSM cardiache e midollari verranno iniettate nella regione periinfartuale. Prima dell¿iniezione le cellule saranno infettate con un lentivirus codificante per la ¿Green Fluorescent Protein¿ (GFP) la cui espressione permetterà l¿identificazione delle cellule trapiantate nel tessuto cardiaco murino. Gli animali verranno sacrificati a 1, 2 e 3 settimane dopo la somministrazione delle CSC. Verranno effettuate le seguenti valutazioni: emodinamica, ecocardiografica ed immunoistochimica.