ATTIVITA¿ CITOPROTETTIVA E ANTI-INFIAMMATORIA DI ENOXAPARINA E DI GLIGANI CON DIFFERENTE STRUTTURA DA ESSA DERIVATI. STUDIO IN VITRO DEL RAPPORTO TRA STRUTTURA MOLECOLARE E ANTIVITA¿ ANTI-TROMBINICA

La trombina (THR) è una serin proteasi ad attività infiammatoria che si genera sia nel torrente circolatorio che localmente a livello tessutale. Numerosi tipi di cellule, incluse le cellule endoteliali del microcircolo cerebrale posseggono recettori per THR e possono quindi essere da questa attivate. A livello cerebrale bassi livelli di THR proteggerebbero i neuroni e la microglia dalle conseguenze degli insulti cerebrali, mentre alti livelli sarebbero causa di retrazione neuronale, proliferazione della gliali, apoptosi e necrosi cellulare. La generazione di THR sembra un fattore patogenetico importante per il decadimento cognitivo non solo nell¿ambito di malattie cerebravascolari acute e croniche ma anche per malattie neurodegenerative come la Malattia di Alzheimer. Dati sperimentali indicano che THR: 1) può indurre la produzione di APP (amyloid precursor protein); 2) può digerire APP generando frammenti tossici di amiloide (Abeta1-42); 3) è presente sia a livello della placca amiloidea che lungo la parete dei capillari cerebrali. Scopo del lavoro. Allo scopo di individuare il rapporto tra struttura e attività riteniamo interessante confrontare la capacità di enoxaparina (LMWH) e di glicani (GAG) da essa derivati di modulare l¿attività biologica e tossica di THR e di Abeta1-42. METODI 1.Preparazione di cellule endoteliali umane. Colture primarie di cellule endoteliali umane (HUVEC) saranno allestite partendo da cordoni ombelicali umani. Il fenotipo cellulare sarà determinato con tecnica immunoistochimica utilizzando anticorpo policlonale anti fattore vW/fattore VIII. 2.Inibizione dell¿attività della trombina. Le HUVEC a confluenza in piastre da 96 saranno incubate con enoxaparina (ENO) o con GAGs. Alla fine dell¿incubazione il sopranatante sarà eliminato e le cellule lavate. THR sarà aggiunta nei pozzetti e la residua attività sarà valutata misurando da sua capacità di digerire uno specifico substrato cromogenico. 3.Inibizione della citotossicita di Abeta1-42 e trombina. HUVEC a confluenza saranno trattate con ENO o GAGs. Alla fine dell¿incubazione il sopranatante sarà eliminato e le cellule lavate. Abeta1-42 o THR saranno aggiunte nei pozzetti e la vitalità cellulare sarà valutata misurando la capacità di convertire MTT in formazano, e determinando il contenuto cellulare di LDH 4. Test di permeabilizzazione endoteliale. Le HUVEC saranno fatte crescere fino alla confluenza in camere a fondo semipermeabile (Transwell, Costar). Il passaggio di tracciante perossidato (45-60kDa) dopo trattamento con Abeta1-42 THR sarà valutato utilizzando HUVEC non trattate, o trattate con ENO o GAGs. 5. Inibizione del rilascio di APP. Le HUVEC a confluenza in fiasche da 25 cm2 saranno trattate con ENO o GAGs per 12-24 ore. Le cellule dopo essere state lavate saranno esposte a THR. A differenti tempi di incubazione il sopranatante sarà recuperato, concentrato, sottoposto a SDS-PAGE e western-blott. APP sarà immunovisualizzato con moab anti-APP.