CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA E PROTEOMICA DI DUE ENZIMI COINVOLTI NELLA VIA BIOSINTETICA DE NOVO DEL NAD(P)

Il fabbisogno di coenzimi piridinici in numerosi microrganismi dipende principalmente da due processi: biosintesi de novo e riciclo dei metaboliti del NAD. In particolare, la via biosintetica de novo del NAD(P), presente in molti patogeni quali M. tuberculosis, H. pylorii, K. pneumoniae, N. meningitidis, S. typhimurium , V. cholerae, B. anthracis e L. monocytogenes, è assente nell¿uomo e costituisce quindi un ideale bersaglio per lo sviluppo di nuove molecole a funzione terapeutica o profilattica. Pertanto sono di fondamentale importanza sia la conoscenza delle proprietà biochimiche e strutturali degli enzimi coinvolti, sia la identificazione dei fattori che controllano la loro espressione e funzionalità in vivo. I primi due passaggi della biosintesi de novo del NAD, catalizzati dai prodotti dei geni nadB (L-aspartato ossidasi o NadB) e nadA (chinolato sintasi o NadA), portano alla produzione di chinolinato a partire da L-aspartato, diidrossiacetonefosfato ed un ossidante che, in condizioni aerobie, è l'ossigeno e in ambiente anaerobio è il fumarato e/o un chinone. Alcuni Autori hanno ipotizzato che i due enzimi facciano parte di un complesso multienzimatico denominato chinolinato sintasi. Mentre la caratterizzazione biochimica e strutturale della NadB da E. coli è stata condotta in precedenti ricerche cui ha contribuito la proponente del presente progetto di ricerca, lo studio della NadA e la caratterizzazione dell¿eventuale complesso tra le due proteine sono stati fortemente limitati dalla instabilità all¿ossigeno della NadA purificata da varie fonti. Pertanto la ricerca proposta si prefigge di purificare e caratterizzare la NadA lavorando in condizioni anaerobie e di studiare la modulazione reciproca delle proprietà di NadA e NadB per cercare di chiarire l¿esistenza del complesso della chinolinato sintasi. In particolare lo studio delle interazioni proteina-proteina prevederà l¿applicazione di metodiche di enzimologia classica quali cromatografia di affinità e attività enzimatica affiancate da studi mediante approcci proteomici quali l¿elettroforesi bidimensionale e la spettrometra di massa.