FARMACOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE DELLA SINAPSI: RUOLO DELLA PROTEINA SNAP-25 NELL¿ECCITABILITA¿ NEURONALE

PRESUPPOSTI: E¿ ormai chiaro che un¿alterazione della regolazione degli ioni calcio potrebbe essere alla base di patologie del SNC caratterizzate da ipereccitabilita¿, quali schizofrenia ed epilessia. Alcuni anni fa abbiamo dimostrato che la proteina SNAP-25 svolge un ruolo nel controllo dei livelli di calcio nei neuroni (Verderio et al., Neuron, 2004) e che tale proteina e¿ espressa diversamente in neuroni eccitatori e inibitori (Frassoni et al., Neuroscience, 2005; Garbelli et , submitted). La regolazione dell¿omeostasi del calcio da parte di SNAP-25 in diverse popolazioni neuronali puo¿ avere conseguenze cruciali per il funzionamento del cervello in condizioni fisiologiche e patologiche. OBIETTIVO: definire i meccanismi molecolari attraverso cui la proteina SNAP-25 controlla le dinamiche di calcio in cellule neuronali e chiarire i processi alla base dell¿espressione differenziale della proteina in diverse popolazioni neuronali. DESCRIZIONE DELLA RICERCA: 1) Tramite trasfezione di costrutti mutati per SNAP-25 e imaging per il calcio su singola cellula, abbiamo identificato i residui amminoacidici specificamente coinvolti nel processo e definito il ruolo cruciale della fosforilazione a carico del residuo ser187 (Pozzi et al., in preparation). Tramite esperimenti di elettrofisiologia valuteremo adesso se la proteina, fosforilata o meno, agisce modulando i canali per il calcio voltaggio-dipendenti in neuroni eccitatori e inibitori. La natura neurotrasmettitoriale dei neuroni registrati verra¿ definita tramite single cell PCR usando primers specifici per i trasportatori vescicolari di GABA o glutammato. 2) Poiche¿ abbiamo dimostrato che animali geneticamente modificati per l¿espressione della proteina (topi Knock out ed eterozigoti per SNAP-25) mostrano diverse caratteristiche della regolazione del calcio (Pozzi et al., in preparation), valuteremo in fettine di ippocampo se i processi di modulazione della trasmissione sinaptica risultano modificati in tali animali. 3) Infine, attraverso esperimenti di immunofluorescenza, biochimica e imaging per il calcio cercheremo di definire i meccanismi che sono alla base della diversa espressione della proteina in neuroni eccitatori e inibitori. A tale scopo condurremo esperimenti in colture neuronali prevalentemente composte da neuroni ecciatori e colture pure di neuroni inibitori. Ci aspettiamo che i nostri risultati forniscano importanti informazioni per la nostra comprensione dell¿attivita¿ del sistema nervoso in condizioni fisiologiche e patologiche.