Il controllo dello stato redox cellulare costituisce un importante adattamento fisiologico implicato nel mantenimento e nel ripristino dell¿omeostasi.
Le cellule tumorali, rispetto a quelle normali, presentano in genere un persistente stress ossidativo correlato a proliferazione incontrollata, resistenza ad apoptosi e a farmaci.
Le specie reattive dell¿ossigeno (ROS) che si formano nelle diverse tappe del metabolismo ossidativo cellulare, agiscono da secondi messaggeri e intervengono nella modulazione della proliferazione e della cascata apoptotica.
I risultati finora ottenuti indicano che melatonina (MLT) e acido alfa-lipoico (ALA), antiossidanti endogeni implicati nei sistemi di difesa antiossidanti, agiscono in modo selettivo e dose-dipendente nelle cellule tumorali inibendo la proliferazione, alterando l¿espressione di alcuni fattori coinvolti nella cascata apoptotica (riduzione di Bcl-2 e incremento di p53), bloccando il ciclo cellulare in G1 e determinando a dosi elevate apoptosi e necrosi. Nelle cellule normali gli effetti citati sono stati riscontrati solo a concentrazioni molto elevate di MLT e ALA e a tempi lunghi.
Inoltre, MLT e ALA, a tempi brevi, attivano alcuni fattori delle vie di segnale (famiglia delle MAP kinasi).
Scopo del presente progetto è proseguire lo studio ¿in vitro¿ del ruolo dello stato redox cellulare nella modulazione delle vie di segnale intracellulari relative a proliferazione, apoptosi e sopravvivenza, in linee cellulari umane tumorali e normali.
Lo studio verrà condotto su due linee cellulari umane, una normale (fibroblasti) e una tumorale (MCF-7: carcinoma mammario) caratterizzata da elevato stress ossidativo.
In particolare verrà investigato l¿effetto di MLT e ALA sulla attivitá di effettori di apoptosi (caspasi) e sulla attivazione di differenti membri della famiglia delle MAP kinasi.
Verrá inoltre verificato se l¿azione della MLT sia mediata dai sottotipi recettoriali di membrana MT1 ed MT2, mediante utilizzo di analoghi antagonisti e anticorpi policlonali.
L¿analisi del ciclo cellulare verrà effettuata in citofluorimetria utilizzando propidio ioduro mentre l¿apoptosi verrá valutata in citofluorimetria mediante Vybrant Apoptosis Assay Kit.
I fattori coinvolti nelle vie di segnale e nella cascata apoptotica verranno analizzati con metodi spettrofotometrci, Western blot/elettroforesi, densitometria a scansione ed ELISA.