Alla base della spermatogenesi c¿è una piccola popolazione di cellule staminali germinali (GSC) [1] che è possibile identificare in diverse specie animali sia di laboratorio (topo, ratto) che domestiche (bovino e suino) [2]. Più recentemente, studi condotti nel topo, hanno messo in evidenza che coltivando in vitro le cellule staminali germinali è possibile ottenere delle linee cellulari che da unipotenti si trasformano in pluripotenti e sono state denominate mGSC, cellule staminali germinali multipotenti [3,4]. Queste cellule presentano le stesse caratteristiche delle cellule staminali embrionali, col vantaggio di potere essere isolate da individui adulti.
Scopo di questo progetto è di sviluppare le metodiche per l¿isolamento e la purificazione delle GSC nel suino come base preliminare per verificare se è possibile ottenere delle linee cellulari pluripotenti anche in questa specie.
Testicoli di suinetto neonato verranno raccolti in allevamento al momento della castrazione e portati in laboratorio. Sulla base dei dati presenti in letteratura il progetto prevede le seguenti fasi:
1. Identificazione delle GSC mediante analisi immunocitochimica dei testicoli fissati ed inclusi in paraffina. Verranno utilizzati anticorpi specifici per: PGP 9.5, OCT4, VASA, CD9.
Per ognuno degli anticorpi verrà testata la capacità di riconoscere l¿antigene specifico nella specie suina mediante western-blot. Una volta accertata la specificità di ogni anticorpo verrà analizzata la capacità del rispettivo antigene di essere associato ad un solo tipo cellulare all¿interno delle varie popolazioni cellulari presenti nel testicolo.
2. Dissociazione del parenchima testicolare mediante digestione enzimatica, utilizzando diverse tipi e concentrazioni di enzimi ed esponendo il tessuto per diversi intervalli di tempo.
L¿efficienza della dissociazione non dovrà compromettere la vitalità cellulare che verrà monitorata con le apposite colorazioni vitali. Infine si controllerà che le procedure consentano di ritrovare le GSC che verranno identificate utilizzando i markers più sensibili in base ai risultati del punto precedente
3. Purificazione delle GSC mediante procedure di arricchimento basate sull¿adesione a superfici ricoperte di laminina associate o meno a sedimentazione su gradiente di BSA. Queste procedure sono state sviluppate in diverse specie, ma sono delicate e non facilmente riproducibili. Si procederà quindi alla loro messa a punto nelle condizioni del nostro laboratorio con l¿obbiettivo di raggiungere un¿efficienza di arricchimento compatibile con la messa in coltura delle GSC.
1.de Rooij DG et al. J Androl 2000;21:776-98.
2.Dobrinski I. Anim Reprod Sci 2005;89:137-45.
3.Guan K, et al. Nature 2006;440:1199-203.
4.Kanatsu-Shinohara M et al. Cell 2004;119:1001.