Clonaggio, espressione in E .coli e Pichia pastoris e studi di folding in vitro per la produzione in forma attiva dell'inibitore di serin-proteasi di tipo Bowman-Birk di lenticchia

I semi delle piante leguminose contengono tra le altre proteine gli inibitori di tipo Bowman-Birk (BBI) che sono caratterizzati dalla capacità di inibire simultaneamente ed indipendentemente in modo irreversibile due serin-proteasi differenti. Trovano applicazione in campo medico-farmacologico nella terapia contro alcune forme di tumori. Peptici sintetici preparati in base alla sequenza corrispondente al motivo consenso responsabile dell¿inibizione, pur conservando l¿attività della proteina intatta, hanno lo svantaggio di venire degradati molto velocemente in vivo. Quindi, poichè la loro purificazione dai semi dei BBI è lunga e tediosa, è necessario ricorrere ad approcci biotecnologici. Con questo progetto si vuole disegnare e sintetizzare un gene sintetico che codifica per uno dei BBI del seme di lenticchia (Lens culinaris) per preparare una serie di costrutti per l¿espressione del gene in E. coli e Pichia pastoris. Nel primo caso si prepareranno due costrutti differenti, uno basato sul vettore pT7.7 e uno sul plasmide pQE30 che prevede la fusione di un tag di poli-istidina. In entrambi i casi l¿accumulo della proteina sarà intracellulare e, come alcuni dati di letteratura testimoniano, verosimilmente avverrà la precipitazione della proteina nei corpi di inclusione. Per questo motivo si renderà necessario utilizzare diverse condizioni sperimentali per la messa a punto di una procedura volta ad ottenere la solubilizzazione ed il corretto refolding in vitro della proteina che garantisca la sua stabilità e funzionalità. Il costrutto che verrà espresso nel lievito prevede invece che il BBI venga secreto nel mezzo di coltura.