Studio del meccanismo di regolazione di fattori di adesione cellulare da parte della proteina CsgD di Escherichia coli
ProjectPresupposti
La produzione di fattori di adesione e di formazione del biofilm e' un determinante di virulenza in molti batteri patogeni. Tra i fattori di adesione dei batteri enterici quali Salmonella enterica ed Escherichia coli vi sono i curli (fibre aggregative) e la cellulosa, entrambe regolate dalla proteina CsgD. In questo progetto ci proponiamo di investigare i meccanismi di interazione DNA-proteina e proteina-proteina del regolatore CsgD.
Obbiettivi
1) Ricostituire le interazioni tra la proteina CsgD con il DNA e con la proteina sigmaS. Studieremo l'interazione di CsgD con i promotori csgB ed adrA, usando tecniche di footprint e di trascrizione in vitro. Il promotore csgB controlla l'espressione dei geni codificanti le subunita' dei curli, mentre il promotore adrA dirige l'espressione di un gene codificante una proteina responsabile della sintesi di GMP-diciclico, una molecola segnale di grande importanza per la produzione di strutture extracellulari. In particolare, testeremo se CsgD interagisce preferenzialmente con la forma dell'RNA polimerasi associata con il fattore sigma alternativo sigmaS (EsigmaS), come suggerito dai dati in vivo. Se cosi' fosse, CsgD sarebbe il primo esempio di un attivatore trascrizionale specifico per EsigmaS.
2) Studiare il ruolo della proteina CsgD come regolatore globale di geni coinvolti nella virulenza e nell'adesione microbica e formazione di biofilm. A questo scopo, studieremo l'interazione della proteina CsgD con due forme di RNA polimerasi batterica: Esigma70 ed EsigmaS utilizzando la metodologia di run-off micro-array (ROMA). Esperimenti di trascrizione in vitro verranno condotti utilizzando l'intero genoma come stampo, sia con Esigma70 che con EsigmaS, in presenza o in assenza di CsgD. Questo esperimento fornira' precise informazioni sull'effetto specifico di CsgD sulla trascrizione da parte delle due forme di RNA polimerasi prese in esame e sulla composizione del regolone CsgD.
La produzione di fattori di adesione e di formazione del biofilm e' un determinante di virulenza in molti batteri patogeni. Tra i fattori di adesione dei batteri enterici quali Salmonella enterica ed Escherichia coli vi sono i curli (fibre aggregative) e la cellulosa, entrambe regolate dalla proteina CsgD. In questo progetto ci proponiamo di investigare i meccanismi di interazione DNA-proteina e proteina-proteina del regolatore CsgD.
Obbiettivi
1) Ricostituire le interazioni tra la proteina CsgD con il DNA e con la proteina sigmaS. Studieremo l'interazione di CsgD con i promotori csgB ed adrA, usando tecniche di footprint e di trascrizione in vitro. Il promotore csgB controlla l'espressione dei geni codificanti le subunita' dei curli, mentre il promotore adrA dirige l'espressione di un gene codificante una proteina responsabile della sintesi di GMP-diciclico, una molecola segnale di grande importanza per la produzione di strutture extracellulari. In particolare, testeremo se CsgD interagisce preferenzialmente con la forma dell'RNA polimerasi associata con il fattore sigma alternativo sigmaS (EsigmaS), come suggerito dai dati in vivo. Se cosi' fosse, CsgD sarebbe il primo esempio di un attivatore trascrizionale specifico per EsigmaS.
2) Studiare il ruolo della proteina CsgD come regolatore globale di geni coinvolti nella virulenza e nell'adesione microbica e formazione di biofilm. A questo scopo, studieremo l'interazione della proteina CsgD con due forme di RNA polimerasi batterica: Esigma70 ed EsigmaS utilizzando la metodologia di run-off micro-array (ROMA). Esperimenti di trascrizione in vitro verranno condotti utilizzando l'intero genoma come stampo, sia con Esigma70 che con EsigmaS, in presenza o in assenza di CsgD. Questo esperimento fornira' precise informazioni sull'effetto specifico di CsgD sulla trascrizione da parte delle due forme di RNA polimerasi prese in esame e sulla composizione del regolone CsgD.