MOBILIZZAZIONE DELLO ZOLFO PER LA PERSOLFURAZIONE DELLA SOLFOTRANSFERASI DI AZOTOBACTER VINELANDII, RHDA: VERSO UN SISTEMA OMOLOGO

La superfamiglia di omologia delle proteine "sulfurtransferase-related" (STP) raccoglie più di 500 sequenze provenienti da tutti i maggiori taxa. L'intermedio persolfurato, che si forma a livello del residuo catalitico (cisteina) come passaggio cruciale dell'attività solfotransferasica, è molto stabile in RhdA di Azotobacter vinelandii, una delle poche STPs che sono state caratterizzate dal punto di vista biochimico e biologico-strutturale (1-3). RhdA, purificata in seguito a sovraespressione in E. coli, si presenta in forma persolfurata (RhdA-SSH; 3). Si è osservato che L-cisteina (CYS) è l'effettiva fonte di zolfo che permette di isolare RhdA-SSH (4). La mobilizzazione dello zolfo della CYS viene mediata dalle cisteine desulfurasi (CDs), enzimi PLP-dipendenti implicati, per esempio, nella biosintesi dei centri Fe-S (5). Le ricerche condotte nell'ambito dello scorso FIRST (2005) hanno permesso di evidenziare che la CD di E. coli, IscS, promuove la persolfurazione di RhdA (4). Per convalidare l'interazione funzionale tra CDs e RhdA anche in un sistema omologo, si propone di: confermare innanzitutto il ruolo delle CDs di E. coli nella persolfurazione di RhdA mediante analisi cinetiche dell'attività CYS:RhdA solfotransferasica con l'ausilio dell'approccio fluorimetrico da noi sviluppato; purificare le 2 CDs (IscS e NifS) caratterizzate di A. vinelandii sovraespresse in E. coli da vettori forniti (D. Dean, Blacksburg, Virginia, U.S.A.) e compararle per la loro attività CYS:RhdA solfotransferasica; purificare/identificare in A. vinelandii la componente che possiede attività CYS:RhdA solfotransferasica, combinando approccio fluorimetrico, HPLC, SDS-PAGE (o 2D-PAGE) e analisi di spettrometria di massa di bande (o spot) selezionate. 1.Pagani et al. (2000)FEBS Lett.472,307 2.Bordo et al. (2000)J.Mol.Biol.298,691 3.Melino et al. (2003)Eur.J.Biochem.270,4208 4.Forlani et al. (2005)FEBS Lett.579,6786 5.Mihara and Esaki (2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.60,12