Identificazione delle proteine nitrate durante il differenziamento di cellule PC12 indotto da NGF

L¿ossido d¿azoto (NO) è un precursore di specie reattive nitranti, quali il perossinitrito e il biossido d¿azoto, in grado di modificare covalentemente le proteine ossidando alcuni residui aminoacilici tra cui la tirosina, che viene modificata in 3-nitrotirosina. Accanto al suo coinvolgimento in condizioni patologiche, negli ultimi anni, un numero sempre maggiore di evidenze sperimentali suggeriscono che la nitrazione delle proteine sia implicata anche in processi fisiologici. In particolare, la ricerca proposta si focalizzerà sul chiarimento del ruolo di questa modificazione post-traduzionale durante il differenziamento neuronale in un sistema cellulare modello (le cellule PC12). In tali cellule l¿NO agisce sia attivando la guanilato ciclasi che nitrando le tirosine, come recentemente dimostrato anche dalle ricerche condotte nel laboratorio di afferenza del proponente, che hanno permesso di osservare che tubulina e TAU sono selettivamente nitrate durante il differenziamento indotto da NGF. Nella ricerca proposta ci si prefigge di identificare se altre proteine citoscheletriche vengano nitrate durante tale processo. Partendo da un omogenato di cellule PC12 differenziate, dopo 5 giorni di stimolazione con NGF, si otterrà la frazione citoscheletrica, le cui proteine saranno separate mediante elettroforesi 2D. Gli spot nitrati saranno individuati mediante western blotting con anticorpi anti NO-tirosina. L¿identificazione delle corrispondenti proteine sarà condotta mediante un approccio proteomico che prevede la digestione in situ con tripsina del materiale proteico contenuto negli spot nitrati e la analisi mediante spettrometria di massa della miscela peptidica ottenuta. Il fingerprint della proteina sarà utilizzato per la ricerca in Banche dati on-line in modo da ottenere l¿identificazione della proteina nitrata e dei residui interessati da tale modificazione post-traduzionale.