Espressione delle diverse isoforme di recettore per la leptina in cellule muscolari scheletriche di topo trattate con l'ormone. Ruolo di Sam68.
ProgettoSam68 è una RNA-binding proteina che interviene nel metabolismo dell¿RNA ma anche nelle vie trasduzionali. Lo stato di fosforilazione sembra cruciale per le funzioni della proteina. E¿ stato riportato che la leptina ingaggia Sam68, come molecola adattatrice, nella trasduzione del segnale. Questo dato ci è parso interessante per la potenziale capacità di Sam68 di operare anche nello splicing alternativo. Infatti esistono diverse isoforme di recettore per la leptina tutte derivate, per splicing alternativo, dal trascritto di un unico gene ma aventi differente capacità funzionale. Variazioni nel processamento del pre-mRNA possono quindi condizionare la responsività o la resistenza all¿ormone. La capacità della leptina di orientare l¿attività di Sam68 verso la modulazione dei suoi stessi recettori si configurerebbe come un meccanismo di autoregolazione della sensibilità ormonale.
In cellule muscolari scheletriche di topo C2C12, responsive alla leptina, abbiamo valutato, in condizioni basali, l¿espressione di mRNA per le due principali isoforme recettoriali, ObRb, funzionalmente più competente e ObRa, con competenze trasduzionali limitate e inoltre abbiamo documentato che ambedue gli mRNA coimmunoprecipitano con Sam68.
OBIETTIVO. Valutare: A) se la leptina acutamente e cronicamente modifichi l¿espressione relativa di mRNA per ObRb e ObRa; B) la eventuale correlazione del fenomeno con variazioni e del legame dei due messaggeri a Sam 68 e dello stato di fosforilazione della proteina.
METODI. Cellule C2C12 saranno trattate acutamente e cronicamente con leptina quindi si valuterà:
1) L¿espressione di mRNA per ObRa e ObRb con RT-PCR;
2) Il legame tra Sam68 e mRNA per ObRa/ObRb : previo chimico cross-linking per stabilizzare i legami Sam68-RNA, su immunoprecipitati di Sam68 si eseguiranno l¿estrazione dell¿RNA e l'RT-PCR per le due isoforme recettoriali;
3) Lo stato di fosforilazione di Sam68 tramite immunoblot con anticorpi anti-pTyr e anti pSer/pThr su immunoprecipitati specifici.
In cellule muscolari scheletriche di topo C2C12, responsive alla leptina, abbiamo valutato, in condizioni basali, l¿espressione di mRNA per le due principali isoforme recettoriali, ObRb, funzionalmente più competente e ObRa, con competenze trasduzionali limitate e inoltre abbiamo documentato che ambedue gli mRNA coimmunoprecipitano con Sam68.
OBIETTIVO. Valutare: A) se la leptina acutamente e cronicamente modifichi l¿espressione relativa di mRNA per ObRb e ObRa; B) la eventuale correlazione del fenomeno con variazioni e del legame dei due messaggeri a Sam 68 e dello stato di fosforilazione della proteina.
METODI. Cellule C2C12 saranno trattate acutamente e cronicamente con leptina quindi si valuterà:
1) L¿espressione di mRNA per ObRa e ObRb con RT-PCR;
2) Il legame tra Sam68 e mRNA per ObRa/ObRb : previo chimico cross-linking per stabilizzare i legami Sam68-RNA, su immunoprecipitati di Sam68 si eseguiranno l¿estrazione dell¿RNA e l'RT-PCR per le due isoforme recettoriali;
3) Lo stato di fosforilazione di Sam68 tramite immunoblot con anticorpi anti-pTyr e anti pSer/pThr su immunoprecipitati specifici.