Analisi funzionale di geni coinvolti nel programma di ematopoiesi/vasculogenesi durante lo sviluppo embrionale di Zebrafish (Danio rerio): Ruolo del gene numb

L'ematopoiesi è un processo differenziativo in cui tutti gli elementi funzionali del sangue si formano a partire da una singola cellula staminale ematopoietica (HSC). Notch regola molteplici aspetti dello sviluppo e del differenziamento cellulare. La sua via di segnalazione sembra essere coinvolta nel mantenimento e nel differenziamento delle HSCs e questa via è influenzata da proteine regolatrici tra le quali la proteina Numb (Allman et al., Imm. Reviews 187, 75-86, 2002). Mediante clonaggio in silico abbiamo isolato nel database di sequenze EST di zebrafish cloni putativi di cDNA codificanti per il trascritto di numb. Abbiamo identificato un clone EST di 2652 bp, codificante per una proteina di 618 aa che all'N-terminale condivide caratteristiche sia con la proteine NUMB e NUMBLIKE umane. L'analisi dell¿espressione spaziale del gene z-numb mediante ibridazione in situ ha evidenziato che numb in zebrafish è espresso in modo simile a quello dell¿embrione di mammifero. Il normale pattern di espressione di z-numb verrà modificato mediante esperimenti di microiniezione allo stadio di 1-2 cellule allo scopo di bloccare in modo specifico il trascritto di z-numb. Disponiamo di un oligonucleotide antisenso numb-MO in grado di bloccare in modo specifico la traduzione di numb. I morfolino possono essere microiniettati negli embrioni di zebrafish e l'effetto sull'embrione è dose-dipendente. L'analisi degli embrioni iniettati ha evidenziato fenotipi con circolazione sanguigna compromessa e la colorazione con o-dianisidina ha rivelato una drastica riduzione del numero di cellule circolantidel sangue. Per identificare alterazioni delle cellule in differenziamento e delle strutture in via di sviluppo e per analizzare in dettaglio il processo di ematopoiesi, i morfanti saranno analizzati a livello molecolare mediante ISH utilizzando marcatori molecolari quali fli1 (emangioblasto), gata2 (HSCs), gata1 (cellule eritroidi e mieloidi), ikaros (progenitori linfoidi).