Ruolo della oligomerizzazione intracellulare nel traffico del recettore del TSH (TSHR) verso la membrana cellulare.

Il nostro interesse per l¿oligomerizzazione dei GPCR deriva dall¿identificazione di alcuni casi familiari di resistenza al TSH causati da mutazioni inattivanti del TSHR. Poiché il difetto era ereditato come tratto dominante abbiamo ipotizzato l¿esistenza di dominanza negativa. Tale ipotesi è stata recentemente confermata mediante approcci funzionali, biofisici (FRET) e di ¿bioimaging¿ (Calebiro, 2005). Abbiamo osservato l¿esistenza nell¿ER di oligomeri formati da TSHR wild-type e mutati che non raggiungono la membrana, fornendo così una base molecolare per la ritenzione intracellulare e la ridotta attività funzionale del TSHR wild-type in presenza dei mutanti. Abbiamo quindi dimostrato che l¿oligomerizzazione è un evento precoce nel traffico del TSHR verso la membrana. L¿obiettivo di questa ricerca è quello di chiarire se la corretta oligomerizzazione recettoriale è richiesta per sfuggire ai controlli di qualità e permettere il trasporto alla membrana. Abbiamo identificato una putativa sequenza segnale deputata alla ritenzione nel reticolo endoplasmatico (ER) nella 2° ansa intracellulare del TSHR. I residui di Arg della sequenza Arg-Leu-Arg saranno mutagenizzate in uno o entrambi i residui con Ala, mutazione non conservativa, o Lys, mutazione senza alterazione di carica. Diverse mutazioni associate a ritenzione in ER saranno riprodotte nel contesto di questi mutanti (doppi mutanti). I costrutti saranno studiati in microscopia confocale e FACS per valutare l'effetto delle mutazioni. Se il motivo Arg-Leu-Arg agisce come segnale di ritenzione nell'ER che è responsabile dell'intrappolamento del recettore mutante, la sua eliminazione dovrebbe permettere di sfuggire il controllo di qualità e consentire l'espressione in membrana del doppio mutante. Inoltre i costrutti mutati nella sequenza suddetta saranno cotrasfettati con singoli mutanti. Questo aiuterà a discriminare tra meccanismi intercatenari o intracatenari di mascheramento del segnale di ritenzione nell'ER.