Analisi dell'espressione genica in popolazioni di cellule epiteliali timiche di topo mediante saggi di immunoprecipitazioned della cromatina.

Presupposti. Nelle cellule epiteliali della midollare del timo (mTEC) vi è l¿espressione ectopica di cluster di geni tessuto-specifici. Questa espressione è controllata da un attivatore trascrizionale denominato AIRE. L¿espressione di geni tessuto-specifici a livello del timo è stata chiamata in causa per spiegare la delezione di cloni di linfociti T autoreattivi nel corso della loro maturazione timica. E¿ stato dimostrato che nei topi ¿knockout¿ per aire si riduce il livello di delezione ed emergono dal timo popolazioni di cellule T mature responsabili di fenomeni autoimmuni. Descrizione ed obiettivo. Ci proponiamo di verificare se tale espressione ectopica sia omogenea a livello di tutte le mTEC o se tale espressione sia distribuita in maniera clonale all¿interno della popolazione cellulare. Al fine di studiare tale fenomeno verranno utilizzati topi transgenici per una variante termosensibile del ¿large T antigen¿ di SV40 posta sotto il controllo del promotore dei geni MHC di Classe I. Le cellule di questo modello animale possono essere coltivate a temperature permissive (33°C) per un tempo indeterminato, durante il quale mantengono una notevole attività proliferativa e possono quindi essere prodotte in quantità sufficienti ad effettuare analisi molecolari. Le cellule epiteliali della midollare timica di questi topi verranno isolate e messe sia in colture massive, sia in condizioni clonali. In seguito si procederà allo studio dell¿espressione genica nelle colture massive e nei singoli cloni mediante metodi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con l¿utilizzo di anticorpi prodotti nel nostro laboratorio diretti contro le lisine in posizione 4 e 9 dimetilate dell¿istone H3. Il DNA precipitato così ottenuto verrà poi utilizzato per verificare i geni in esso contenuti tramite ibridazione con DNA-microarrys al fine di determinare eventuali variazioni nei cluster di geni espressi. Nell¿ipotesi della omogeneità delle mTEC non ci si aspetta di ottenere variazioni significative nelle diverse colture clonali rispetto alla coltura massiva. Al contrario, nell¿ipotesi dell¿eterogeneità delle mTEC le differenze tra cloni saranno certamente significative.