Presupposti. In precedenza abbiamo dimostrato, in modelli sperimentali di infiammazione indotta nella zampa di ratto (artrite), l¿effetto analgesico della molecola oATP, che è un inibitore selettivo dei recettori P2X7 dell¿ATP extracellulare (che esercita un¿azione pro-dolorifica). Ora ci proponiamo di studiare l¿effetto antinocicettivo di oATP nel dolore neuropatico e nel dolore viscerale, utilizzando appositi modelli sperimentali. Inoltre, poiché alcuni mediatori, quali il TNFa, inducono segnali pro-infiammatori e pro-nocicettivi anche attraverso l¿attivazione dell¿endotelio, abbiamo pensato di studiare in vitro l¿effetto di oATP sull¿attivazione endoteliale TNFa-indotta.
Descrizione
Il dolore neuropatico verrà indotto mediante legatura del nervo sciatico destro, a livello della suddivisione del nervo in tre rami, in topi BALB/c di 6-8 settimane. Dopo 5 e 10 giorni dall¿intervento, verrà eseguito un ¿plantar test¿ per valutare il dolore neuropatico. La somministrazione di oATP localmente (nella zona intraplantare) avverrà ogni giorno, a partire dal giorno dell¿intervento, alla dose di 4 mg/kg di peso dell¿animale. Il dolore viscerale verrà indotto mediante l¿inoculo di di 0.3 ml di acido acetico allo 0.6% nel peritoneo dei topi. Il numero di contrazioni addominali, a partire da 5 minuti dopo l¿inoculo di acido acetico, verrà calcolato per un tempo di 20 minuti in ogni animale. La somministrazione di oATP (4 mg/kg) per via intraperitoneale verrà eseguita 30 minuti prima dell¿inoculo di acido acetico.
Le cellule endoteliali (HUVEC), isolate da cordone ombelicale umano mediante collagenasi, verranno coltivate in apposito medium di coltura. Verranno studiati, in presenza ed in assenza di differenti concentrazioni di oATP, sulle HUVEC: 1) l¿espressione delle molecole di adesione ICAM1, VCAM1, VE-caderina, in presenza o in assenza di TNFa (200 U/ml); 2) l¿espressione dei recettori per il TNFa (TNFR1 e TNFR2); 3) la vitalità cellulare e la capacità proliferativa; 4) la apoptosi e l¿attività mitocondriale 5) la migrazione transendoteliale.
Obiettivo specifico
I) Identificare l¿efficacia antinocicettiva di oATP in modelli sperimentali differenti da quelli dell¿artrite
II) Identificare il ruolo di oATP nell¿antagonizzare l¿attività dei mediatori pro-dolorifici quali TNFa