Attività antiproliferativa in vitro dell'anticorpo monoclonale anti-CD30 SGN-30 su linee di carcinoma embrionale
ProjectIl carcinoma embrionale (CE), tumore in genere molto maligno e solitamente avente sede nelle gonadi ( ovaio, ma soprattutto testicolo), deriva da un teratoma o da cellule staminali tumorali che rappresentano la controparte maligna delle cellule staminali embrionali. Allo scopo di migliorare i risultati clinici nei pazienti con CE ad alto rischio, ci proponiamo di studiare l'antigene CD30, le cui funzioni biologiche sono solo parzialmente note, e le vie di trasduzione del segnale ad esso collegate come bersaglio terapeutico di particolare interesse data la disponibilità per l'uso clinico di anticorpi monoclonali anti-CD30 (es SGN-30).
Il primo obbiettivo sarà quello di analizzare in vitro l'effetto antiproliferativo di SGN-30 su linee cellulari di CE esprimenti l'antigene CD30. Si utilizzerà un pannello di 5 linee: NTERA-2, TERA-1, TERA-2, NCCIT, Cates-1B (acquistate da DSMZ o ATCC ). Per valutare la sensibilità delle singole linee cellulari all'azione antiproliferativa di SGN-30, le cellule tumorali verranno incubate per 24 - 48 ore con concentrazioni scalari di SGN-30 in presenza o meno di un anticorpo anti-IgG umane come cross-linker. Alla fine dell'incubazione, saranno eseguiti: conteggi assoluti delle cellule vitali mediante FACS e determinazione della vitalità con MTT assay, analisi del ciclo cellulare e test di apoptosi mediante doppia marcatura con Annessina V/ioduro di propidio.
Poichè durante il differenziamento delle linee cellulari CE e delle cellule staminali embrionali il pathway di Notch è deregolato il secondo obiettivo sarà valutarne il ruolo nelle linee cellulari in esame e saggiare se il trattamento con l'anticorpo SGN-30 possa alterare la segnalazione da parte di Notch. Esamineremo quindi l'espressione di geni codificanti ligandi, recettori ed effettori distali del pathway in seguito a trattamento con SGN-30. L'attivazione del pathway di Notch sarà rilevata misurando la trascrizione di geni target, in particolare HES, HERP e HEY
Il primo obbiettivo sarà quello di analizzare in vitro l'effetto antiproliferativo di SGN-30 su linee cellulari di CE esprimenti l'antigene CD30. Si utilizzerà un pannello di 5 linee: NTERA-2, TERA-1, TERA-2, NCCIT, Cates-1B (acquistate da DSMZ o ATCC ). Per valutare la sensibilità delle singole linee cellulari all'azione antiproliferativa di SGN-30, le cellule tumorali verranno incubate per 24 - 48 ore con concentrazioni scalari di SGN-30 in presenza o meno di un anticorpo anti-IgG umane come cross-linker. Alla fine dell'incubazione, saranno eseguiti: conteggi assoluti delle cellule vitali mediante FACS e determinazione della vitalità con MTT assay, analisi del ciclo cellulare e test di apoptosi mediante doppia marcatura con Annessina V/ioduro di propidio.
Poichè durante il differenziamento delle linee cellulari CE e delle cellule staminali embrionali il pathway di Notch è deregolato il secondo obiettivo sarà valutarne il ruolo nelle linee cellulari in esame e saggiare se il trattamento con l'anticorpo SGN-30 possa alterare la segnalazione da parte di Notch. Esamineremo quindi l'espressione di geni codificanti ligandi, recettori ed effettori distali del pathway in seguito a trattamento con SGN-30. L'attivazione del pathway di Notch sarà rilevata misurando la trascrizione di geni target, in particolare HES, HERP e HEY