Determinazione della 5-metil-deossicitidina quale indicatore del grado di metilazione del DNA genomico mediante LC-MS/MS

La metilazione del DNA svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della trascrizione e nella degradazione del DNA estraneo, con cui la cellula entra in contatto (1). Tale evento epigenetico avviene ad opera di alcuni enzimi - DNA metil-tranferasi ¿ che in presenza di donatori del gruppo metilico, come l¿S-adenosil metionina, vanno a metilare selettivamente la citosina all¿interno del dinucleotide citidina-guanosina (CpG). La metilazione de novo che avviene su DNA estraneo che porta con se geni attivi e che può andare ad integrarsi al DNA cellulare riguarda in particolare la metilazione del promotore che inibisce l¿espressione del gene stesso rappresentando per la cellula un conosciuto meccanismo di difesa (2). Il tratto gastrointestinale è la porta principale d¿entrata di nuove molecole di DNA e l¿epitelio intestinale rappresenta un immediato sito di contatto per il DNA estraneo alimentare. Prove sperimentali hanno già dimostrato che frammenti di DNA di batteriofago M13 somministrato nel topo con l¿alimento si ritrovano nel nucleo delle cellule dell¿intestino tenue, in altri organi linfatici e nel fegato (3). Alla luce di tali evidenze scientifiche diventa legittimo chiedersi quale sia l¿effetto dell¿eventuale integrazione di DNA estraneo, anche quello alimentare, sul grado di metilazione del DNA della cellula. Infatti la determinazione del grado di metilazione della deossicitidina può fornire diverse informazioni sulle condizioni del DNA cellulare in diversi tessuti e più in generale diventare un indicatore di uno stress cellulare che ha condotto all¿attivazione di meccanismi genetici di riparazione. La presente ricerca riguarderà lo sviluppo di una metodologia di cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS/MS) per la determinazione quantitativa del grado di metilazione della deossicitidina. Le condizioni separative in LC e le condizioni di ionizzazione in elettrospray (ESI) verranno ottimizzate. Un primo approccio applicativo della metodologia riguarderà la determinazione del grado di metilazione in campioni di DNA estratto da tessuti provenienti da specie ittiche allevate e alimentate con fonti proteiche di diversa origine. (1) Doerfler W. (2005) Biochem. 70: 505-524. (2) Van den Veyver I.B. (2002) Annu.Rev. Nutr. 22: 255-282. (3) Schubbert R, Renz D., Schmitz B., Doerfler W. (1997) PNAS USA 94: 961-966.