Evoluzione del muscolo scheletrico nei vertebrati: ruolo del gene Nfix nello sviluppo muscolare di teleostei e mammiferi
Progetto Negli amnioti, il muscolo scheletrico è un tessuto formato in fasi successive da diverse classi di progenitori miogenici: mioblasti embrionali, fetali e cellule satelliti (Biressi et al, 2007). Il controllo molecolare delle transizioni da una fase all’altra, fondamentale per una corretta miogenesi, è ancora poco noto. Recentemente, sono stati identificati geni espressi in modo differenziale nei mioblasti murini embrionali e fetali (Biressi et al. 2007); in particolare il fattore trascrizionale NfIx risulta presente nel feto ed assente nell’embrione (Biressi et al. 2007). Analizzando le funzioni di NfIx in vitro, è stato evidenziato che è in grado, da solo o formando complessi con fattori fetali specifici (PKC-Q), di attivare la trascrizione di geni specifici fetali (Muscle creatin Kinase, b-enolasi) e di reprimere geni specifici embrionali (slow Myosin heavy Chain). Sono stati inoltre generati topi transgenici, nei quali NfIx viene eliminato nel muscolo scheletrico o alternativamente espresso durante la miogenesi embrionale (Messina et al. submitted). Il pesce teleosteo Zebrafish (Danio rerio) presenta caratteristiche uniche per studiare le funzioni di NfIx e il suo ruolo nello sviluppo muscolare. Infatti in zebrafish non è evidente una distinzione tra la miogenesi embrionale e fetale: è verosimile che in questo vertebrato sia presente un solo programma miogenico, poichè un differenziamento muscolare precoce offre una valida opportunità di sopravvivenza dell’embrione che ha uno sviluppo esterno alla madre e quindi non protetto. Inoltre, lo sviluppo dell’embrione avviene in breve tempo (i precursori muscolari compaiono dopo sole 12 ore dalla fecondazione) e la miogenesi può essere seguita facilmente in ogni sua fase, permettendo una caratterizzazione dei domini di espressione dell’omologo di NfIx in zebrafish mediante ibridazione in situ e sezioni istologiche. Dal punto di vista funzionale, in zebrafish è possibile effettuare esperimenti di perdita e di guadagno di funzione di un gene mediante microiniezione, direttamente negli embrioni, rispettivamente di oligonucleotidi antisenso gene-specifici e RNA messaggeri. Gli effetti della perdita e del guadagno di funzione del gene NfIx verranno analizzati in termini di espressione di geni muscolari quali slow Myosin heavy Chain, Muscle creatin Kinase e b-enolasi, già validati nel modello murino, con l’intento di identificare possibili alterazioni dello sviluppo o del differenziamento muscolare. Inoltre sono disponibili, e già presenti nel nostro laboratorio, linee di pesci transgenici e mutanti in geni muscolari che potrebbero essere regolati da nfIx. Infine, tecniche di microarray rappresentano il metodo più rapido per identificare un gran numero di geni target in vivo comparando il pattern di espressione degli embrioni con perdita e guadagno di funzione di nfIx con il pattern di espressione degli embrioni di controllo.