Identificazione e caratterizzazione di microRNA coinvolti nei processi di apoptosi dei monociti bovini

Introduzione e background I microRNA (miRNA) rappresentano una nuova classe di molecole di RNA a basso peso molecolare in grado di inibire la trascrizione, o di indurre la degradazione, di mRNA codificanti proteine che contengono sequenze complementari ai miRNA stessi (Bartel et al. 2004) Benché il ruolo specifico di molti miRNA non sia ancora noto, la caratterizzazione funzionale di alcuni di essi permette di ipotizzare che queste piccole molecole di RNA siano coinvolte in numerosi processi fisiologici (Ambros et al., 2004) e patologici (Wienholds et al., 2005). I miRNA vengono attualmente riconosciuti come importanti regolatori della infiammazione e della risposta innata (Bi et al., 2008). Si ritiene che ogni genoma codifichi per circa 1000 miRNA (Bentwich et al., 2005). La espressione della maggior parte dei miRNA è tessuto specifica (Coutinho et al. 2007), e nel bovino sono stati fino ad ora condotti studi su diversi tessuti; (Gu et al., 2007; Hammerle-Fickinger et al., 2009) Obiettivi del progetto Lo scopo del seguente progetto di ricerca è di identificare quali miRNA siano coinvolti nella regolazione dei processi di apoptosi dei monociti bovini, valutata mediante misurazione dell'attività della caspasi 7. I monociti bovini verranno purificati mediante magnetic sorting utilizzando come antigene il recettore CD14. I monociti purificati verranno incubati con staurosporina, un induttore dell’apoptosi. L’mRNA verrà purificato a vari stadi di apoptosi, utilizzando come controllo le cellule senza staurosporina. Il monitoraggio verrà eseguito tramite RT-qPCR con sonde specifiche verso un pannello di miRNA scelto sulla base delle informazioni disponibili riguardo i monociti di uomo e topo. Al fine di realizzare una corretta normalizzazione dei dati di espressione, i geni di controllo endogeno verranno preventivamente selezionati all’interno di un pannello di miRNA candidati (fra cui let-7a, miR-16, miR-21, miR-26b, miR-150, ecc.) tramite analisi della stabilità di espressione condotta con algoritmi geNorm e NormFinder (Anderson et al. 2004) Il gruppo proponente. Il gruppo proponente è costituito da: Dr Fabrizio Ceciliani, DVM, PhD, appartenente al DIPAV, , che svolgerà anche il ruolo di coordinatore del progetto, fornirà la sua competenza per quello che riguarda la purificazione e la attivazione dei leucociti Prof Alberto Luciano, BSc, PhD, appartenente al DSA, che fornirà la sua competenza per quello che riguarda lo studio della apoptosi. Dr Michele, Mortarino, DVM, PhD, appartenente al DIPAV, che fornirà la sua competenza dal punto di vista molecolare. Bibliografia Ambros V, 2004, Nature 431: 350 Anderson C, 2004, Cancer Res. 64:5245 Bartel DP, 2004, Cell 116:281 Bentwich I, 2005, Nat Genet 37:766. Bi Y, 2008, J Cell Physiol 218:467. Coutinho LL, 2007, Physiol Genomics 29:35 Gu Z, 2007, FEBS Lett 581:981 Hammerle-Fickinger A, 2009, Biotechnol Lett. In press; Wienholds E, 2005, FEBS Lett 579:5911-59