Il battito cardiaco dei mammiferi è generato e regolato a livello del nodo del seno dall'azione coordinata di diversi tipi di canali ionici che danno origine al potenziale d'azione cardiaco. I canali HCN (isoforme HCN1 e HCN4) sono responsabili della corrente ionica iperpolarizzante If, detta anche corrente “pacemaker” (DiFrancesco D. 1993 Annu Rev Physiol.55:455-72). I canali HCN sono inoltre il target della modulazione del ritmo cardiaco operata dal sistema nervoso mediante i neurotrasmettitori adrenalina (tachicardizzante) e acetilcolina (bradicardizzante). Entrambe queste sostanze agiscono sui canali HCN variando la concentrazione cellulare di AMPc, una molecola in grado di legarsi ai canali HCN, modulandone l’attività o gating.
In questo progetto ci proponiamo di studiare il meccanismo di regolazione degli HCN, analizzando le variazioni che insorgono nella loro struttura in seguito al legame con l’ AMPc. Il sito di legame dell’AMPc, denominato CNBD (cyclic nucleotide binding domain), si trova nella porzione finale, detta c-terminale, della proteina. La porzione c-terminale è un dominio citosolico, escluso dalla membrana idrofobica in quanto solubile. Si pensa che la porzione c-terminale funzioni da elemento di regolazione dell’attività del canale, interagendo sia con i domini transmembrana che formano il poro, sia con altre proteine regolatrici presenti nel citosol. Lo studio verrà effettuato sulle porzioni c-terminali di HCN1 e HCN4 prodotte in batteri e purificate per cromatografia d’affinità. Le tecniche d’indagine utilizzate saranno di chimica fisica, spettroscopia, biochimica e cristallografia a raggi X (in collaborazione con il lab del Prof. Bolognesi, U. Milano). Verranno studiate sia le proteine selvatiche (wild type) che le proteine mutate, già identificate in pazienti con disfunzioni cardiache (Milanesi et al., 2006 N Engl J Med. 354(2):151-7. Abbiamo già ottenuto i primi cristalli del dominio CNBD di HCN1 e stiamo preparando il dominio CNBD di HCN4, oltre ai due domini citosolici full length. Le proteine verranno inoltre utilizzate per studi spettroscopici utilizzando dicroismo circolare e spettroscopia Raman e infrarossa (in collaborazione con il prof. Arkin, U. of Jerusalem) per valutare i cambiamenti di struttura secondaria, orientazione, accessibilità all’acqua e stabilità delle proteine, in seguito al legame con l’AMPc. L’ottenimento di informazioni sulla struttura atomica dei canali HCN e delle modificazioni conformazionali determinate dal legame con la molecola di AMPc, ci permetterà di produrre un modello computazionale di dinamica molecolare con cui iniziare uno studio applicativo mirato alla selezione di molecole con potenzialità terapeutiche.