Ruolo delle glicoidrolasi associate alle membrane plasmatiche nella formazione, organizzazione e funzione di domini lipidici di membrana e nel processo di trasduzione del segnale attraverso la membrana plasmatica.
Progetto I lipid rafts di membrana sono arricchiti in glicolipidi, colesterolo e proteine. Variazioni della loro composizione modulano il processo di trasduzione dei segnali.
I glicolipidi sono sintetizzati nell’apparato del Golgi e raggiungono poi la membrana plasmatica, sulla quale possono essere trasformati da glicoidrolasi e glicosiltransferasi associate alla membrana stessa.
La sialidasi di membrana Neu3 mostra elevata specificità per i gangliosidi ed esprime attività di tipo trans-cellulare partecipando, in funzione della attività espressa, alla riorganizzazione della membrana plasmatica. Un aumento di attività di Neu3 determina una risposta antiapoptotica con conseguente progressione del tumore in cellule tumorali. In opposizione, causa un parallelo aumento di ceramide con conseguente attivazione del processo di apoptosi in fibroblasti normali umani. Alle membrane plasmatiche di cellule nervose oltre alla sialidasi Neu3 è associata una sialiltransferasi. Le loro attività sono associate al differenziamento cellulare e ciò suggerisce l’esistenza di un ciclo di sialilazione-desialilazione capace di promuovere grandi cambiamenti nelle proprietà di trasferimento dell’informazione lungo la membrana.
Più recentemente sono state identificate essere associate alla membrana plasmatica, a seguito di processi di fusione con lisosomi, esosaminidasi, galattosidasi e glucosidasi, e una glucosidasi, denominata GBA2, con struttura diversa dall’enzima lisosomale. Tutti questi enzimi mostrano attività trans.
DESCRIZIONE DEL PROGRAMMA.
Fibroblasti umani e cellule di neuroblastoma in coltura saranno utilizzati nella ricerca, variando il contenuto di uno dei quattro enzimi, Neu3, galattosidasi o glucosidasi (GBA1 e GBA2), mediante overespressioni e silenziamenti stabili.
Le colture cellulari saranno sottoposte a feeding con opportuni precursori radioattivi così da marcare metabolicamente gli sfingolipidi, i glicerofosfolipidi e le proteine. I lipid rafts saranno preparati con il metodo basato sulla loro caratteristica resistenza alla solubilizzazione a freddo in 1%Triton X-100. Gli sfingolipidi e i glicerofosfolipidi saranno analizzati mediante HPTLC seguita da autoradiografia.
Il pattern proteico associato alla frazione arricchita in sfingolipidi sarà analizzato mediante SDS-PAGE ed elettroforesi bidimensionale seguita da autoradiografia.
OBIETTIVI
1-Preparare colture cellulari a diversa espressione di sialidasi, galattosidasi e glucosidasi di membrana plasmatica e valutare il cross-talk tra i tre enzimi e la loro relazione con quelli lisosomali.
2-Caratterizzare la composizione lipidica ed in parte proteica dei lipid rafts in funzione di differenti livelli di sialidasi, di galattosidasi e glucosidasi associate alle membrane plasmatiche.
3-Caratterizzare le proteine interagenti con i gangliosidi in funzione della diversa espressione di Neu3, galattosidasi e glucosidasi associate alla membrana plasmatica.