Il problema della quantificazione dello stress ossidativo: studio dell'interazione dell'ossido nitrico con le principali globine
Progetto Presupposti. Come noto, le specie reattive ossidate (ROS), tra cui l'ossido nitrico (NO), normalmente prodotti 'in vivo' in notevole concentrazione, possono ossidare biomolecole come lipidi, proteine e lo stesso DNA, contribuendo in tal modo all'insorgenza di numerose patologie tra cui cancro, arteriosclerosi, patologie cardiovascolari e infiammatorie.
Recenti studi hanno confermato la capacità delle emoproteine, ovvero delle proteine il cui centro funzionale è costituito da un anello porfirinico contenente un atomo di ferro (Fe), l'eme, di legare, tra i vari ligandi di interesse funzionale (O2, CO2), l'NO, suggerendo in tal modo l'ipotesi che, oltre al tradizionale ruolo di riserva e trasporto dell' O2, esse fungano da 'scavenger' dei ROS.
Secondo tale ipotesi, l'emoglobina(Hb) svolge questo ruolo a livello ematico e pertanto esteso a tutto l'organismo, mentre altre globine assolvono allo stesso compito a livello di specifici distretti: la mioglobina (Mb) nel muscolo, la neuroglobina nel cervello.
Tra le varie tecniche spettroscopiche, utilizzabili per lo studio dell'interazione delle globine con i ROS, la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) offre il sicuro vantaggio di essere un metodo intrinsecamente quantitativo (il segnale NMR è infatti determinato dal numero degli spin eccitati) e quindi in grado sia di monitorare la cinetica e il rendimento di reazioni la cui completa catena non è del tutto nota, sia di valutare quantitativamente i prodotti e quindi la resa delle reazioni stesse.
Obiettivo. La presente ricerca si propone di studiare l'interazione dell'NO con il ferro dell'eme di Hb e Mb, con NMR del protone (1H) e dell'azoto (15N)al fine di valutare in modo quantitativo sia la cinetica che i prodotti di reazione, i cui intermedi non sono a tutt'oggi del tutto noti.
Metodi Spettri 15N-1H NMR saranno acquisiti utilizzando spettrometri ad alta risoluzione (400-500 MHz Bruker Avance, corredati di probe 5mm 1H con gradienti di campo) su campioni a concentrazione crescente di Mb ed Hb nitrosilata nella forma ridotta (HNO), ottenuti aggiungendo Sale di Angeli (NaNO2) marcato in 15N a soluzioni (2H2O/H2O (1:9, v/v), tampone fosfato, pH=7.0) di Hb e Mb precedentemente ottenute in forma deossigenata.
Mediante tecniche bidimensionali (NOESY-COSY) e monodimensionali sarà possibile ottenere dati strutturali per determinare gli intermedi di reazione e, attraverso la stechiometria di reazione, valutare l'efficienza funzionale di legame.