Utilizzo della ibridazione in situ e della immunofluorescenza per MBNL1 e canale del cloro nella biopsia muscolare del paziente miotonico distrofico e non distrofico.
Progetto Presupposti
Le sindromi miotoniche comprendono le miotonie non distrofiche (miotonia congenita), causate da mutazioni del canale del cloro o del sodio, e dalle distrofie miotoniche. Le distrofie miotoniche (DM) sono malattie neuromuscolari a carattere autosomico dominante caratterizzate da miotonia ereditaria e ridotta espressione del canale del cloro (ClC1), altamente espresso nel muscolo scheletrico. Esistono due tipi di DM, la distrofia miotonica di tipo 1 (DM1) causata dall¿espansione della ripetizione CTG nella regione 3¿UTR del gene DMPK, e la distrofia miotonica di tipo 2, causata dall¿espansione della ripetizione CCTG nell¿introne 1 del gene ZNF9. Queste mutazioni originano un meccanismo molecolare mediato dall¿RNA in cui i trascritti contenenti le espansioni si accumulano nei nuclei delle cellule interferendo con la biogenesi dell¿mRNA di specifici geni tra cui il gene di ClC1 (CLCN1). I trascritti trattenuti nei nuclei sotto forma di inclusioni ribonucleari interferiscono con proteine RNA-binding quali le proteine della famiglia muscleblind-like (MBNL).
Descrizione della ricerca
Utilizzando la tecnica dell¿ibridazione in situ fluorescente (FISH) mediante sonde specifiche è possibile evidenziare le inclusioni ribonucleari nei nuclei delle cellule dei pazienti DM. Attualmente nel nostro laboratorio, l¿applicazione di tale metodica su sezioni di muscolo scheletrico, ci ha permesso di giungere alla diagnosi definitiva di DM2 in una casistica di più di 50 pazienti sospetti di essere affetti da tale malattia. Attraverso l¿utilizzo di una sonda RNA (CAGG)5, è possibile evidenziare le inclusioni ribonucleari presenti nei nuclei delle fibre muscolari dei pazienti DM2. Tale sonda non è in grado di ibridare le inclusioni presenti nei pazienti DM1 permettendo una diagnosi differenziale delle DM. In un recente studio condotto su pazienti miotonici sia distrofici che non-distrofici, abbiamo evidenziato che il sequestro di MBNL1 nei nuclei delle fibre muscolari è presente solo nei pazienti con distrofia miotonica dove sono presenti anche le inclusioni ribonucleari. Nei pazienti miotonici non distrofici non si evidenzia un¿anomala distribuzione della proteina MBNL1 nella fibra muscolare.
Obiettivi della ricerca
Si pensa di effettuare un¿indagine sull¿espressione del canale del cloro nel muscolo scheletrico di questi pazienti. L¿indagine in immunofluorescenza, utilizzando un anticorpo specifico per ClC1, sarà effettuata sia su pazienti DM1 e DM2 che su pazienti affetti da miotonia congenita. Tra i pazienti DM verranno presi in considerazione sia pazienti con miotonia grave sia pazienti in cui la miotonia è più lieve o non si è ancora manifestata per verificare se esiste una correlazione tra gravità della miotonia ed espressione del canale del cloro ClC1.