L'Ubiquitinilazione regola la stabilità del trasportatore del glutammato EAAC1: possibili implicazioni nella patogenesi del Parkinson

Il trasportatore neuronale di aminoacidi acidi EAAC1 (Excitatory amino acid carrier 1) è il trasportatore del glutammato espresso in neuroni maturi e gioca un ruolo importante nel controllo della trasmissione glutammatergica, grazie alla capacità di ricaptare il neurotrasmettitore rilasciato nello spazio intersinaptico. Esso rappresenta anche il principale sistema di trasporto di cisteina, precursore del glutatione, il principale antiossidante intracellulare (Danbolt 2001. Prog Neurobiol. 65:1-105). L'espressione in superficie e la degradazione di EAAC1 sono finemente modulate dall'interazione con proteine accessorie e dall'attivazione di vie di trasduzione del segnale. Nel modello cellulare costituito da cellule epiteliali MDCK (Madin Darby canine kidney), in cui il trasportatore è endogenamente espresso e media il riassorbimento di aminoacidi acidi, abbiamo recentemente evidenziato la presenza di un dominio di interazione con proteine PDZ (lavoro sottomesso). La rimozione di questo dominio causa l'internalizzazione e la rapida degradazione del trasportatore in compartimenti lisosomiali, suggerendo la presenza di segnali di degradazione nella sequenza di EAAC1. Obiettivo della ricerca proposta è determinare quali siano i segnali che controllano la degradazione di EAAC1. Studi condotti negli ultimi anni hanno evidenziato come l'ubiquitinilazione controlli la degradazione via lisosomi di proteine di membrana. Nella coda carbossi terminale del trasportatore, a monte della sequenza di interazione con PDZ, sono presenti delle lisine, potenziali siti di ubiquitinilazione. Vogliamo perciò indagare se tali lisine siano effettivamente ubiquitinilate e rappresentino il segnale che indirizza il trasportatore ai compartimenti lisosomiali per la degradazione. A tale proposito le lisine saranno mutagenizzate in arginina e le proteine ricombinanti verranno espresse in cellule MDCK. La stabilità dei trasportatori mutagenizzati verrà valutata biochimicamente attraverso esperimenti di pulse-chase e l'eventuale accumulo in compartimenti lisosomiali verrà valutata tramite esperimenti di immunofluorescenza indiretta. Una down regolazione dell'attività di trasporto del glutammato è stata osservata nel Parkinson, una patologia neurodegenerativa caratterizzata da stress ossidativo e deplezione delle riserve di glutatione. Vogliamo valutare se tale down regolazione sia dovuta ad alterazioni dello stato di ubiquitinilazione di EAAC1 e conseguente degradazione. A tale proposito utilizzeremo cellule 5YSY trattate con MPTP (1-Methyl-4-phenyl-tetrahydropyridine), un modello in vitro ampiamente utilizzato per studi sulla patogenesi del Parkinson (Yao et al, 2004: Acta Pharmacol Sin, 25: 855-860). In questo modello valuteremo se trattamento con MPTP causi alterazioni nella espressione del trasportatore e nella sua ubiquitinilazione tramite esperimenti di western blotting ed esperimenti di pulse-chase.