Presupposrti
Le giunzioni cellula-cellula dell' endotelio proteggono i
vasi da un aumento incontrollato della permeabilità, dall'infiammazione e dalla trombosi.
Le giunzioni, non sono solo siti di ancoraggio, ma possono anche trasferire segnali diretti a
limitare la crescita e l'apoptosi delle cellule endoteliali.
Le cellule endoteliali possiedono almeno due tipi di giunzioni: giunzioni aderenti (AJs) e giunzioni strette(TJs). In entrambi i tipi di giunzione, l'adesione è
mediata da proteine transmembrana che promuovono interazioni omotipiche e formano una struttura a cerniera lungo il bordo della
cellula. Le cellule endoteliali esprimono delle molecole di adesione specifiche, come la VE-caderina alle AJs e claudina 5 alle TJs.
Attraverso la loro coda citoplasmatica le molecole delle giunzioni legano proteine citoschetriche e/o segnalatrici che permettono
l'ancoraggio ai filamenti di actina e trasferiscono segnali intracellulari.
Descrizione ed obiettivi della ricerca
La corta coda citoplasmatica della VE-caderina interagisce con tre differenti proteine della famiglia "armadillo" (beta-catenina, placoglobina e p120).
La beta-catenina, se rilasciata dalle giunzioni e stabilizzata nel citoplasma, puo' traslocare al nucleo e influenzare la trascrizione attraverso il legame a fattori trascrizionali della famiglia LEF/Tcf. In questo progetto proponiamo di investigare il ruolo della beta catenina nelle risposte funzionali dell' endotelio.
Abbiamo utilizzato il sistema Cre/Lox per l'inattivazione specifica della
beta-catenina nelle cellule endoteliali durante lo sviluppo embrionale. Gli embrioni mutanti muoiono in utero entro 11,5 giorni di sviluppo, per
alterazioni nella morfogenesi vascolare. Da questi embrioni abbiamo coltivato cellule endoteliali beta-catenina -/- .
Queste cellule saranno infettate con vettori retrovirali codificanti per: 1) due costrutti LEF/Tcf che sono potenti induttori
dell'attività trascrizionale della beta-catenina ma che non legano la VE-caderina e non hanno alcun effetto alla
membrana; 2) un costrutto chimerico dove la coda della VE-caderina è legata alla beta-catenina: in questo caso la
beta-catenina non può traslocare a nucleo ma è capace di promuovere l'organizzazione delle giunzioni aderenti; 3)
forme mutanti di beta-catenina incapaci di attività trascrizionale ma in grado di legare la VE-caderina; 4) le medesime
forme mutanti del punto 3) ma trattenute in membrana attraverso la fusione con connessina. La segnalazione di
beta-catenina/TCF verrà misurata attraverso l'uso di un gene reporter. In questi transfettanti studieremo alcune
funzioni importanti delle cellule endoteliali come apoptosi, proliferazione cellulare o tubulogenesi e l'espressione dei
geni modulati dalla VE-caderina.