Ruolo della proteine della classe delle di-guanilato ciclasi nell'espressione di geni codificanti per fattori di adesione e di virulenza in batteri Gram negativi.

Presupposti La produzione di fattori di adesione e di formazione del biofilm è un determinante di virulenza in molti batteri patogeni, ivi inclusi patogeni opportunisti quali Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. La regolazione di questi fattori di adesione coinvolge spesso complessi meccanismi di trasduzione del segnale dipendenti da stimoli ambientali e/o fisiologici. Tra i fattori di regolazione, la molecola segnale GMP-diciclico (c-di-GMP) svolge un ruolo fondamentale in questi processi regolativi. Il c-di-GMP viene prodotto da enzimi della classe della diguanilato ciclasi, altrimenti detti proteine GGDEF, dalla sequenza amminoacidica caratteristica del loro sito catalitico. Obbiettivi 1) Identificare proteine GGDEF coinvolte nella produzione di polisaccaridi extracellulari (EPS). Mentre il c-di-GMP è molto conservato tra i batteri, è totalmente assente nelle cellule degli eucarioti superiori, rendendo quindi gli enzimi coinvolti nel metabolismo del c-di-GMP un bersaglio interessante per inibitori specifici. Intendiamo mettere a punto una strategia di screening per identificare quali proteine GGDEF possano fungere da target interessante per potenziali inibitori di enzimi coinvolti nel metabolismo del c-di-GMP e quindi del biofilm batterico. A tale scopo abbiamo messo a punto ceppi batterici incapaci di produrre polisaccaridi extracellulari in seguito a mutazioni in geni regolatori. Questi mutanti presentano un fenotipo bianco quando piastrati su terreni di coltura addizionati del colorante Rosso Congo. La trasformazione di questi mutanti con plasmidi che portano geni codificanti per proteine GGDEF può portare alla riattivazione della produzione di polisaccaridi extracellulari, che sarà rilevabile tramite colorazione rossa su terreno con Rosso Congo. I ceppi mutanti verranno trasformati con plasmidi che portano geni codificanti per proteine GGDEF sia di E. coli che di altri batteri (es. P. aeruginosa, A. baumannii). Si potrà così stabilire in un modo semplice e diretto quali proteine GGDEF siano attivi nella stimolazione della produzione di EPS, e quindi possano essere target interessanti per lo sviluppo di inibitori. 2) Studiare il ruolo delle proteine GGDEF nella regolazione di geni coinvolti nella virulenza e nell¿adesione microbica e formazione di biofilm. Alcuni geni codificanti per proteine GGDEF sono in grado di influenzare la produzione di EPS tramite regolazione dell¿espressione genica. Il secondo obiettivo consiste nello studiare in dettaglio questo aspetto: pertanto, si studierà il ruolo delle proteine GGDEF direttamente coinvolte nella produzione di EPS identificate nel saggio precedente. Verranno costruiti mutanti di delezione dei geni codificanti proteine GGDEF di interesse, e si misurerà l¿espressione di geni codificanti noti fattori di adesione sottoposti al controllo del c-di-GMP, quali ad esempio i geni codificanti i curli (fimbrie aggregative) o coinvolti nella sintesi di EPS quali la cellulosa o l¿alginato.