BASI MOLECOLARI DELLA REGOLAZIONE DELLA TIROSINA IDROSSILASI DA PARTE DI UN AGONISTA DEL RECETTORE A2A DELL'ADENOSINA IN CELLULE DI FEOCROMOCITOMA
Progetto La tirosina idrossilasi (TH) è l'enzima che catalizza la prima reazione di biosintesi delle catecolamine, cioè la conversione della tirosina in L-DOPA che viene poi trasformata in dopamina. L'espressione di TH aumenta in risposta a stimoli ipossici a livello delle cellule di tipo I nel corpo carotideo; la dopamina rilasciata è importante per l'induzione di fenomeni adattativi quali l'iperventilazione e l'aumento dell'attività dei nervi del sistema nervoso simpatico.
La linea cellulare di feocromocitoma PC12 mostra molte caratteristiche comuni alle cellule di tipo I del corpo carotideo e rappresenta un modello sperimentale in vitro ampiamente utilizzato per studiare l'espressione della TH in seguito a stimoli diversi.
E' stato dimostrato che in questa linea cellulare l'espressione della TH aumenta durante l'ipossia mediante l'attivazione del fattore trascrizionale HIF-1 (Schnell et al. J. Neurochem. 85, 483-491, 2003). Chiare evidenze dimostrano, inoltre, che l'adenosina, molecola prodotta dalla degradazione dell'ATP in condizioni d'ipossia, induce l'espressione della TH tramite i fattori trascrizionali CREB e AP-1 (Chae and Kim, Mol. Brain res. 44:31-38, 1997; Lewis-Tuffin et al. Mol. Cell. Neurosci. 25:536-547, 2004).
Dal momento che abbiamo dimostrato recentemente che l'adenosina induce, in una linea macrofagica, il fattore trascrizionale HIF-1 (De Ponti, J Leukoc Biol 82:392-402, 2007), vorremmo valutare ora l'attività del fattore trascrizionale HIF-1 e l'eventuale coinvolgimento nell'attivazione della TH nelle cellule PC12 stimolate con adenosina o con un agonista del recettore A2A.
Verrà analizzata l'espressione di TH a livello di RNA messaggero e di proteina con tecniche di Northern blot e Western blot rispettivamente. Verrà misurata la capacità di legame del fattore trascrizionale HIF-1 ad un oligonucleotide contenente la sua specifica sequenza bersaglio e verranno misurati i livelli di proteina nucleare, mediante tecniche di Western blot. Per analizzare la regolazione trascrizionale del gene della TH, verrà trasfettato il promotore normale e mutato nel sito di legame di HIF-1, posto a monte del gene reporter della luciferasi e comparata la sua attività in risposta agli stimoli.
Per determinare il ruolo dell'adenosina in condizioni ipossiche nella modulazione di HIF-1 e della TH, le cellule PC12 verranno trattate con un antagonista del recettore A2A in condizioni d'ipossia e misurati mediante Western blot i livelli di HIF-1 e TH.
I risultati attesi potranno fornire indicazioni sui meccanismi di regolazione dell'espressione della TH in seguito a stimoli che mimano la condizione ipossica, condizione particolarmente cruciale per il tessuto nervoso e per l'induzione di risposte adattative.