Caratterizzazione e validazione di RNA messaggeri come target per la rilevazione e quantificazione di microrganismi trasmessi da vettori nel cane
Progetto Il cane è ospite di numerosi microrganismi patogeni trasmessi da vettori (Ehrlichia spp, Anaplasma spp, Babesia spp, Leishmania spp, ecc). La diagnosi di infezione a livello ematico e linfoematopoietico, oltre che sulle metodologie classiche dirette e indirette, si può basare anche su metodiche molecolari di rilevazione di acidi nucleici del patogeno (usualmente PCR). La principale limitazione della PCR convenzionale per DNA genomico è che essa non fornisce informazioni sulla vitalità ed infettività dei patogeni, poichè ha come bersaglio il DNA che notoriamente può persistere nell'organismo ospite, a seconda delle condizioni, per un tempo apprezzabile (nell'ordine di giorni o settimane) dopo, per esempio, una trasmissione da vettore non seguita dallo stabilirsi di una vera infezione bensì soltanto da una transitoria positività alla PCR. Da qui l'utilità di realizzare metodologie che siano in grado di correlare la presenza, e la quantità, del microrganismo patogeno alla sua effettiva vitalità e, possibilmente, alla sua capacità di moltiplicazione. In particolare, in letteratura è già riportato che la rilevazione di RNA messaggero (RNAm) di patogeni nell'ospite è possibile, e consente di identificare e quantificare i patogeni vitali (a differenza di quanto accade con le metodiche molecolari che rilevano il DNA genomico), in quanto l'RNAm ha generalmente ha una emivita molto breve ed è presente in forma integra solamente in cellule vitali.
Il presente progetto si propone di realizzare una serie di metodologie di rilevazione e quantificazione di microrganismi patogeni trasmessi da vettore nel cane (Babesia canis, Leishmania infantum, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophylum, Hepatozoon canis) attraverso la misurazione dei livelli di RNAm targets espressi dai patogeni stessi in sangue e tessuti linfoematopoietici quali aspirato linfonodale, midollare e splenico. A questo riguardo, il presente progetto si propone di utilizzare il monitoraggio quali-quantitativo di espressione genica relativo ai patogeni in questione, mediante reverse transcriptase PCR (RT-PCR) convenzionale e in real time condotta su targets di cDNA ottenuto tramite retrotrascrizione di RNAm integro. Il progetto sarà articolato in quattro attività: 1) indagine diagnostica su soggetti clinicamente sani e con sospetto clinico ai fini dell'ottenimento di campioni di controllo positivo, di controllo negativo e per il monitoraggio di espressione dei microrganismi nell'ospite; 2) messa a punto delle metodiche di monitoraggio quali-quantitativo di espressione dei microrganismi nell'ospite; 3) monitoraggio di espressione dei microrganismi in campioni di campo; 4) Analisi dei dati. Il progetto avrà come risultato principale l'elaborazione di parametri di espressione genica dei patogeni da utilizzare come ausilio per la valutazione diagnostica e/o prognostica dei soggetti, anche in comparazione con i metodi di PCR tradizionali.