Costruzione e caratterizzazione di una genoteca del batterio intramitocondriale Midichloria mitochondrii (ordine Rickettsiales)
Progetto Precedenti indagini sulla zecca dura Ixodes ricinus ci hanno consentito di descrivere un nuovo genere (Midichloria) ed una nuova specie (Midichloria mitochondrii) nell¿ambito dell¿ordine Rickettsiales (Int J Syst Evol Microbiol 56: 2535). M. mitochondrii è l¿unico batterio intramitocodriale descritto (Appl Env Microbiol 70: 2596). Le indagini condotte con il supporto di precedenti finanziamenti FIRST ci hanno consentito di rilevare che questo batterio è ampiamente diffuso nelle zecche Ixodidae (Env Microbiol 8: 1280), con numerose specie positive in diverse aree geografiche (Parasitology 135: 485). Inoltre, abbiamo rilevato la presenza del batterio nelle ghiandole salivari in varie specie di zecche (in preparazione). In via preliminare, attraverso l¿analisi di campioni ematici di equini esposti a zecche della specie Rhipicephalus bursa, abbiamo ottenuto evidenze circa l¿infettività di Midichloria per i mammiferi. Midichloria rappresenta dunque un nuovo genere batterico, ampiamente diffuso nelle zecche e potenzialmente trasmissibile ai mammiferi.
Il mantenimento di Midichloria in colture cellulari non ha ancora consentito di ottenere rese utili al fine di eseguire indagini sperimentali sulla biologia di questo organismo. Inoltre, il basso tasso di replicazione di questo batterio in cellule in vitro non consente di ottenere materiale antigenico utilizzabile per indagini sieroepidemiologiche o per la generazione di anticorpi. Il sequenziamento del genoma di questo batterio rappresenterebbe una strategia indipendente dalla coltura che permetterebbe di: 1) generare informazioni utili per la comprensione di aspetti della biologia di Midichloria; 2) identificare geni codificanti per proteine con possibile ruolo antigenico.
Questo progetto si pone l¿obiettivo di generare una genoteca shotgun di Midichloria e di procedere al sequenziamento di un numero consistente di cloni, compatibilmente con l¿entità del finanziamento ottenibile (i.e. 500-1500 cloni). La realizzazione del progetto consentirà di: 1) porre le basi per un sequenziamento completo del genoma di Midichloria; 2) ottenere le sequenze di un numero rappresentativo di geni di questo microrganismo, ragionevolmente alcune centinaia; 3) generare sequenze di geni codificanti per potenziali antigeni, su cui porre le basi per la generazione di antigeni ricombinanti e di anticorpi.
La strategia sperimentale prevede le seguenti fasi: 1) isolamento di oociti da femmine della zecca I. ricinus; 2) enucleazione degli oociti al fine di ridurre/eliminare il DNA genomico della zecca; 3) amplificazione del DNA totale presente nel citoplasma degli oociti (principalmente DNA di Midichloria) mediante multiple displacement amplification (MDA); 4) sonicazione del DNA amplificato, end-repair e clonaggio in vettori plasmidici; 5) sequenziamento di un migliaio di cloni ed analisi bioinformatiche per la predizione delle caratteristiche dei geni ottenuti e delle proteine potenzialmente codificate.