Studio genetico e biochimico di proteine dello spazio intermembrana mitocondriale in pazienti con deficit di citocromo c ossidasi
Progetto La citocromo c ossidasi (COX) è un metalloenzima che costituisce il complesso IV della catena respiratoria mitocondriale. E' formata da 13 subunità di cui 3 codificate dal DNA mitocondriale (mtDNA) e 10 a codifica nucleare.
Deficit nell'attività della COX sono stati associati a mutazioni puntiformi del mtDNA. Tuttavia, le attuali conoscenze sulle forme mendeliane di questo difetto biochimico (con presentazioni cliniche che variano da difetti tessuto-specifici a disordini sistemici) sono ancora limitate. Variazioni patogeniche sono state evidenziate in alcuni geni responsabili dell'assemblaggio del multienzima (COX10, SCO1, SCO2, SURF1). Le proteine codificate da alcuni di questi geni sono importate nel mitocondrio attraverso la proteina canale TOM e si localizzano nello spazio intermembrana (IMS) grazie all'esistenza di uno specifico meccanismo di trasporto (pathway di Mia40). Le proteine che lo realizzano sono state recentemente associate da un punto di vista biochimico con il citocromo c e la citocromo c ossidasi. I geni che le codificano si presentano pertanto come buoni candidati per spiegare le forme autosomico recessive di deficit di COX ad eziologia ignota.
Ci proponiamo di realizzare lo studio di alcune di queste proteine in pazienti che presentano un marcato deficit di COX. Si tratta di soggetti mitocondriopatici giovani o adulti con una presentazione clinica non compatibile con mutazioni in geni noti. L'analisi istologica del tessuto muscolare mostra, al saggio immunoenzimatico, una netta riduzione della COX.
L'analisi genetica e biochimica si articolerà nei seguenti punti:
- screening dei geni nucleari noti codificanti le subunità della COX;
- studio quantitativo e qualitativo delle proteine appartenenti al pathway di Mia40 mediante Western blot (su tessuto muscolare) e dosaggio immunocitochimico (su fibroblasti e mioblasti);
- in caso di entità o distribuzione anomale di una di queste proteine effettueremo lo screening del gene che le codifica per rintracciare eventuali mutazioni e studieremo il locus nei pazienti e nei loro familiari mediante analisi di microsatelliti;
- ricerca di ulteriori loci candidati sulla base di sequenze presegnale di localizzazione mitocondriale e in base alla presenza di motivi ritenuti consenso (come i motivi CXXC con doppiette di cisteine in grado di realizzare ponti disolfuro, elementi consueti nelle proteine del pathway di Mia40);
- identificazione di mutazioni causative seguita dalla caratterizzazione funzionale del gene.
Lo studio molecolare dei deficit di COX potrebbe essere particolarmente utile nella diagnosi di questi disordini clinicamente eterogenei. Sarebbe inoltre fondamentale nella comprensione di fenomeni biologici di base come l'assemblaggio della COX, il suo funzionamento e il trasporto delle proteine nel mitocondrio. L'esame delle proteine dell'IMS e della loro relazione con la catena respiratoria mitocondriale potrà fornire nuovi elementi di rilevanza clinica e scientifica.